[發明專利]基于冷凍構建金納米探針的相對DNA步行器引發指數擴增檢測蓖麻毒素的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202110496824.2
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113151414B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 高志賢;王瑜;彭媛;李雙;韓殿鵬;任舒悅;秦康;韓鐵;李森;孫璇
• 申請（專利權）人: 軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 高爽

本發明屬于蛋白毒素檢測領域，涉及一種基于冷凍構建金納米探針的相對DNA步行器引發指數擴增檢測蓖麻毒素的方法及試劑盒。本發明的方法主要有4個過程：冷凍構建金納米探針，蓖麻毒素和金納米探針競爭結合適配體，相對DNA步行器和指數擴增反應。本發明的方法和試劑盒可以在實際應用中以較高的靈敏度，良好的特異性和優異的穩定性檢測蓖麻毒素。

技術領域

本發明屬于蛋白毒素檢測領域，具體地，涉及一種基于冷凍構建金納米探針的相對DNA步行器引發指數擴增檢測蓖麻毒素的方法，以及一種基于冷凍構建金納米探針的相對DNA步行器引發指數擴增檢測蓖麻毒素的試劑盒。

背景技術

蓖麻是大戟科蓖麻屬植物，為含油量較高的油料作物。但蓖麻植株的莖、葉或蓖麻的籽實中含有有毒物質，主要包括蓖麻毒素、蓖麻堿及蓖麻血球凝集素等。其中，蓖麻毒素也稱蓖麻毒蛋白，是迄今所知毒性最強的植物毒蛋白，毒性約是氰化物的6000倍。蓖麻毒素主要存在于蓖麻蛋白中 (約占蓖麻蛋白的5％，分子量約為64-66kD)，是一種Ⅱ型異二聚體核糖體失活蛋白，由核糖體失活酶(蓖麻毒素A鏈)及與半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特異結合的凝集素(蓖麻毒素B鏈)組成，二者之間由一個二硫鍵連接。在25℃時，蓖麻毒素可在較大范圍的酸堿溶液中反復結冰和溶解，但其毒性仍保持不變。

蓖麻毒素具有很強的毒性作用，毫克級的劑量即可致人或動物死亡。由于分布廣泛、易于獲得、致命性強等特點，被一些國家軍方深入研究并制作為化學武器。截至目前，適用于人的解毒藥和特異性抗毒素特效藥尚未被研制出來。因此，建立蓖麻毒素快速、準確、靈敏的檢測方法引起了國內外學者的廣泛關注。

根據蓖麻毒素的理化性質、生物化學特性及免疫學特性，建立了免疫吸收分析、生物傳感器分析及生物質譜分析等方法。免疫標記及放射免疫方法具有檢測靈敏度高的特點，但其對于相對繁雜的抗體制備及特殊標記物的要求，限制了該方法的大量推廣應用；生物質譜法雖然借助于高科技的儀器設備，但高昂的儀器設備使得檢測費用大大增加，不適合做現場檢測。因此，建立快速、準確的生物傳感器檢測方法，將成為蓖麻毒素檢測方法的研究重點，從而為臨床治療提供理論依據。

在常用的DNA分子機器中，DNA步行器主要由3個元素組成：驅動力，步行鏈和步行軌道。根據步行鏈的移動方式和軌道范圍，DNA步行器可分為 3種類型：1D線性軌道，2D平面軌道和3D納米粒子表面軌道。值得注意的是，基于球形金納米顆粒的3D軌道比1D或2D軌道具有更大的比表面積和 DNA密度，因此可以加快DNA步行器反應的速度。因此，本發明開發了一種新的相對運動3D DNA步行器方法。其中，金納米顆粒創新的采用冷凍法快速合成，同時采用指數擴增放大熒光信號。

發明內容

針對現有檢測方法的缺點，本發明要解決的技術問題是建立一種簡單、便捷、高靈敏度的生物傳感器技術，即基于冷凍構建金納米探針的相對DNA 步行器引發指數擴增的新型方法，以實現食品中蓖麻毒素的痕量檢測，并實現定量分析。

為了實現上述目的，本發明提供一種基于冷凍構建金納米探針的相對DNA步行器引發指數擴增檢測蓖麻毒素的方法，包括以下步驟：

1)冷凍構建金納米探針：采用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒，將巰基和PolyA雙標記的DNA與三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽孵育，然后將制備的金納米顆粒與DNA混合孵育，將溶液用HEPES緩沖液洗滌，最后將沉淀重懸于HEPES緩沖液中，并在黑暗中保存；通過此方法分別合成AW和AT；

所述AW為DNA Walker-金納米探針，DNA Walker序列為： 5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅AACTATACAACCTCAGCATTAGTCAAGAGGTA-3'(SEQ ID NO：1)；

所述AT為DNA Track-金納米探針，DNA Track序列為： 5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅TACCTCTTGACTAATGCTGAGGTTGTATAGTT-3'(SEQ ID NO：2)；