[發明專利]基于冷凍構建金納米探針的相對DNA步行器引發指數擴增檢測蓖麻毒素的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202110496824.2
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113151414B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 高志賢;王瑜;彭媛;李雙;韓殿鵬;任舒悅;秦康;韓鐵;李森;孫璇
• 申請（專利權）人: 軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 高爽

1.一種非診斷的基于冷凍構建金納米探針的相對DNA步行器引發指數擴增檢測蓖麻毒素的方法，包括以下步驟：

1)冷凍構建金納米探針：采用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒，將巰基和PolyA雙標記的DNA與三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽孵育，然后將制備的金納米顆粒與DNA混合孵育，將溶液用HEPES緩沖液洗滌，最后將沉淀重懸于HEPES緩沖液中，并在黑暗中保存；通過此方法分別合成AW和AT；

所述AW為DNA Walker-金納米探針，DNA Walker序列為：5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅AACTATACAACCTCAGCATTAGTCAAGAGGTA-3'（SEQ ID NO：1）；

所述AT為DNA Track-金納米探針，DNA Track序列為：5'-SH-(A)₂₀(T)₁₅TACCTCTTGACTAATGCTGAGGTTGTATAGTT-3'（SEQ ID NO：2）；

2)蓖麻毒素的競爭反應：反應前將蓖麻毒素適配體在高溫孵育，然后逐漸冷卻至室溫，再將AW、適配體和含蓖麻毒素的待測樣品混合并孵育；反應結束后離心用PBS洗滌溶液；重懸沉淀，得到AW'；

所述蓖麻毒素適配體的序列為：5'-ATAGGAGTCACGACGACCAGAACCGTAGGT TCGGGGTCGGAGTGGTCCGGAAGATGGCGTGGTATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3'（SEQ ID NO：3）；

3)相對DNA步行器過程：相對DNA步行包括：所述AW'，所述AT， Nb.BbvCI切口酶，緩沖液和水；

4)指數擴增反應：指數擴增反應體系包括：模板DNA、緩沖液、dNTP，ssDNA產物、ThermoPol緩沖液、Nt.BstNBI切口酶，Vent（exo^-）DNA聚合酶，MgSO₄和水；

所述模板DNA的序列為：5'-AACTATACAACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACC TCAA-3'（SEQID NO：4）；

所述ssDNA產物的序列為5'-TGAGGTTGTATAGTT-3'（SEQ ID NO：5）;

5)熒光強度測定：在反應前，將MB在高溫孵育，然后在PBS中逐漸冷卻至室溫；然后，將MB溶液與步驟4)的擴增產物混合，并在室溫下孵育；反應完畢后，使用熒光分光光度計測量熒光強度；

所述MB的序列為：5'-FAM-CTGGAGAACTATACAACCTCACTCCAG-BHQ1-3'（SEQ ID NO：6）。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，還包括制作蓖麻毒素標準曲線的步驟，根據步驟1)-5)測試不同濃度蓖麻毒素，通過熒光強度對不同濃度蓖麻毒素的響應，得到測定蓖麻毒素的標準曲線。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，還包括實際樣品預處理步驟：將實際樣品在12000-13000 rpm下離心5-15分鐘，取上清并將其pH值調節至7.0。

4.根據權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，步驟1）包括：

采用檸檬酸鈉還原法制備15nm左右的金納米顆粒；將巰基和PolyA雙標記的DNA與三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（TCEP）以1：80-120的摩爾比在室溫下孵育0.5-2小時；然后將2-5nM制備的金納米顆粒與8-12μM DNA在-15℃至-25℃下以1：200的摩爾比混合孵育30-150min；室溫解凍后，將溶液用0.04-0.06 M，pH 7.5-7.8的HEPES緩沖液于4℃以12000-15000 rpm離心并洗滌；最后將沉淀重懸于HEPES緩沖液中，并在黑暗中于4℃保存。