[發(fā)明專利]一種多酶級聯(lián)制備對香豆酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110496791.1
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113265431B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 龔大春;張書銀;肖開興;萬里;宋婷;楊瀟;任立偉;郭金玲
• 申請（專利權(quán)）人: 三峽大學(xué)
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務(wù)所 42103
• 代理人: 成鋼

本發(fā)明提供了一種多酶級聯(lián)催化合成對香豆酸的方法。以對羥基苯丙酮酸為原料，經(jīng)過羰基還原酶還原為對羥基苯基乳酸，然后通過脫水酶制備對香豆酸。本方法可以在管式反應(yīng)器?膜分離耦合裝置中進(jìn)行連續(xù)化生產(chǎn)，也可以在間歇反應(yīng)釜法，羰基還原酶所需要的輔酶NAD(P)H通過葡萄糖脫氫酶和葡萄糖反應(yīng)再生。每批羰基還原酶、葡萄糖脫氫酶、脫水酶均可回收利用5次以上，生產(chǎn)效率最高可達(dá)到50 g/L.h。本發(fā)明生產(chǎn)成本低、效率高、產(chǎn)品純度好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶催化領(lǐng)域；更具體地說，是涉及一種多酶級聯(lián)催化合成對香豆酸的方法。

背景技術(shù)

對香豆酸(4-羥基肉桂酸或反式4-香豆酸，p-Coumaric acid，p-CA)，廣泛存在于植物中，是白花蛇舌草、杜仲葉等植物的有效成分，具有預(yù)防心血管疾病、抗氧化等生物活性，是合成類黃酮、異黃酮、芪類等高價值保健品的中間體，如柚皮素、花青素、槲皮素、兒茶素、白藜蘆醇、羥基酪醇和咖啡酸等；在農(nóng)業(yè)行業(yè)用于植物生長促進(jìn)劑；在食品行業(yè)用于長效殺菌劑和果蔬保鮮防腐劑。在化妝品行業(yè)由于對香豆酸對酪氨酸單酚酶和二酚酶均有抑制作用，所以添加到化妝品里抑制黑色素的生成。

同時它也是重要的精細(xì)化工原料。通過降解反應(yīng)生成對羥基苯甲酸；對香豆酸還可作為祛痰藥杜鵑素、抗腎上腺素藥物艾司洛爾等物質(zhì)合成的中間體，還可以用于臨床上治療輕、中度老年癡呆的藥物-加爛他敏的合成。因此尋找高效、綠色的對香豆酸及其衍生物制備方法已經(jīng)成為國內(nèi)外研究熱點。

目前，對香豆酸的制備主要有植物提取、化學(xué)合成和生物合成3種方法。其中植物提取存在植物生長周期長、收集半徑大、萃取效率低等問題；化學(xué)合成則面臨能耗高、反應(yīng)時間長及環(huán)境污染等問題；而生物合成則具有低成本、高產(chǎn)率和綠色環(huán)保等優(yōu)勢，被認(rèn)為是最有前景的生產(chǎn)方法。

在生物合成方法中有酶催化法和從頭合成法兩種。

其中，酶催化的專利有：(1)“一種酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法”，專利申請?zhí)枮?01911167675.4，該專利申請是以肉桂酸為原料，利用反式-肉桂酸-4-單加氧酶(EC1.14.14.91)進(jìn)行催化合成，添加了還原型輔酶供體，價格十分昂貴，底物濃度可以達(dá)到100g/L，收率未報到。(2)“一種反式肉桂酸-4-羥基化酶及其編碼基因與應(yīng)用”，專利號為：201710136604，該發(fā)明利用石蒜屬植物忽地笑的反式肉桂酸-4-羥化酶進(jìn)行催化合成，該途徑所有的羥化酶也是屬于植物細(xì)胞色素P450酶EC1.14.14.91，但其產(chǎn)率僅為0.4g/L。

微生物從頭合成法：專利號為：201510411910，名稱為“一種酵母菌的用途及天然對香豆酸的生產(chǎn)方法”公開了利用酵母細(xì)胞發(fā)酵發(fā)生產(chǎn)反式-4-香豆酸，產(chǎn)量可達(dá)10g/L左右。也有期刊文獻(xiàn)報道利用釀酒酵母生物合成法對香豆酸的，合成產(chǎn)量僅僅達(dá)1.9g/L。

上述方法均存在產(chǎn)率不高、酶源單一、制備成本高等問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種多酶級聯(lián)制備對香豆酸的方法，本發(fā)明方法與上述方法均不同，以對羥基苯丙酮酸為原料，采用羰基還原酶、葡萄糖脫氫酶和脫水酶3種體外酶多酶級聯(lián)耦合的方法，在管式反應(yīng)器或間歇反應(yīng)器中催化合成對香豆酸，反應(yīng)體系簡單，酶可以回收利用，輔酶可以原位再生，大大降低成本，提高產(chǎn)率。

本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種多酶級聯(lián)制備對香豆酸的方法，以對羥基苯丙酮酸為原料，經(jīng)過羰基還原酶還原為對羥基苯基乳酸，再通過脫水酶制備得到對香豆酸。

進(jìn)一步地，所述羰基還原酶還原過程中需要輔酶NAD(P)H，其采用葡萄糖脫氫酶和葡萄糖反應(yīng)再生。

更進(jìn)一步地，該方法在管式反應(yīng)器-膜分離耦合裝置中進(jìn)行連續(xù)化生產(chǎn)，即經(jīng)過一級管式反應(yīng)、一級超濾酶回收系統(tǒng)、二級管式反應(yīng)和二級超濾酶回收系統(tǒng)實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)；或采用一個管式反應(yīng)器或一個間歇反應(yīng)釜，分步添加不同的酶實現(xiàn)對香豆酸的間歇化生產(chǎn)。

再進(jìn)一步地，該制備方法的具體步驟為：