[發明專利]一種多酶級聯制備對香豆酸的方法

有效

• 申請號: 202110496791.1
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113265431B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發明（設計）人: 龔大春;張書銀;肖開興;萬里;宋婷;楊瀟;任立偉;郭金玲
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 成鋼

1.一種多酶級聯制備對香豆酸的方法，其特征在于：以對羥基苯丙酮酸為原料，經過羰基還原酶還原為對羥基苯基乳酸，再通過脫水酶制備得到對香豆酸；其中羰基還原酶為近平滑假絲酵母ATCC7330的羰基還原酶，利用重組菌 E.coliBL21（DE3）/ pACYCDuet-1-cpcr均質破碎制得羰基還原酶還原過程中需要輔酶NAD(P)H，其采用葡萄糖脫氫酶和葡萄糖反應再生；所述脫水酶為產胞芽孢桿菌Clostridium sporogenes的液體酶制劑的脫水酶，酶活為3000U/L, 脫水酶液體酶制劑的添加量為對羥基苯基乳酸底物的質量的1-5%。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：該方法在管式反應器-膜分離耦合裝置中進行連續化生產，即經過一級管式反應、一級超濾酶回收系統、二級管式反應和二級超濾酶回收系統實現連續化生產；或采用一個管式反應器或一個間歇反應釜，分步添加不同的酶實現對香豆酸的間歇化生產。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，該制備方法的具體步驟為：

S1、第一級管式反應酶催化工序：在溫度為20-40℃、pH為6-9條件下，添加對羥基苯丙酮酸、葡萄糖，羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶進行反應，反應時間為1-3小時；后進入第一級超濾酶回收工序；

S2、第一級超濾酶回收工序：采用有機膜超濾設備對反應體系進行過濾，膜孔徑為5-20kD；得到的羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶進行回收至S1中循環利用；

S3、第二級管式反應酶催化工序：S2中的滲透液進入通過第二級管式反應器內，在溫度為15-35℃、pH為7-10條件下添加脫水酶進行反應，反應時間為1-3小時，后進入第二級超濾工序；

S4、第二級超濾酶回收工序：采用有機膜超濾設備對S3所得反應體系進行過濾，膜孔徑為30-50kD；得到的脫水酶回收至S3中循環利用；透過液進入結晶工序，結晶析出對香豆酸，過濾，干燥得產品。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：S1中，羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶均以液體酶制劑形式加入；羰基還原酶液態酶制劑的添加量為對羥基苯丙酮酸底物的質量1-5%，葡萄糖脫氫酶的添加量為葡萄糖質量的2-6%。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：S1中，反應介質為雙水相體系或者有機溶劑單相體系或者水/有機溶劑體系。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：S2中羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶回收5次以上，回收過程中根據需要補充相應的羰基還原酶和/或葡萄糖脫氫酶液體酶制劑。

7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：S4中脫水酶回收5次以上，回收過程中根據需要補充≤30%的脫水酶液體酶制劑；結晶時溫度降低至-5-5℃。