[發明專利]牛體外受精胚胎培養和凍存的方法

有效

• 申請號: 202110493547.X
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN112980778B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 王娜;王小武;韓勇權;郝少強;趙明禮;郭春明;許曉椿
• 申請（專利權）人: 天津博裕力牧科技有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.牛體外受精胚胎培養和凍存的方法，其包括如下步驟：

將成熟的卵丘-卵母細胞復合體在受精培養液中洗滌1次，再轉移到受精培養液中，放入培養箱中，備用；

從液氮中取一支凍精細管，37℃水浴解凍；無菌操作剪開細管兩端，使精液注入盛有精液制備培養液的15mL離心管中，328×g離心2次，每次5min，離心后棄上清；將300μL精液制備培養液加入上述離心管，重懸精子沉淀，取適當的精子懸液進行精子計數；

將計算好體積的精子懸液加入盛有卵母細胞的受精培養液滴中，并將培養盤放入培養箱，使精卵共孵育16-20h，培養條件為38.8℃、5.5-6.5% CO₂、飽和濕度，完成體外受精操作；

體外受精操作完畢后，將胚胎周圍的顆粒細胞用剝卵針去除干凈，放入胚胎培養液中培養，此時記為胚胎培養的第1天，培養條件為38.8℃、6% O₂、88% N₂、飽和濕度，第3天記錄卵裂率；第7天記錄囊胚率，至第9天時統計囊胚孵化率，并進行質量鑒定；

將可用胚胎在保存液中洗滌3次，在平衡液中平衡10min后轉移入冷凍液，按5段裝液法裝入胚胎，做好標記，再放入程序降溫儀中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，將胚胎細管迅速取出，置入液氮中冷凍保存；

在需要使用冷凍保存的胚胎時，從液氮中取出細管，在空氣中停留5s，放入37°C水浴中，待冰晶全部融化為止，剪開細管，將胚胎迅速移入解凍液中，室溫下保持5min，然后將胚胎放入胚胎培養液小滴內培養，完成解凍過程；

其中，

所述受精培養液是包含112.0mM 氯化鈉、4.02mM 氯化鉀、2.25mM的氯化鈣二水合物、0.52mM六水氯化鎂、0.83mM磷酸二氫鉀、37.0mM碳酸氫鈉、1.25mM丙酮酸鈉、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、10umoL/L α-硫辛酸、25μg/ml葉酸、3mg/ml谷氨酸鈉的水溶液，

所述精液制備培養液是包含112.0mM 氯化鈉、4.02mM 氯化鉀、2.25mM的 氯化鈣二水合物、0.52mM六水氯化鎂、0.83mM磷酸二氫鉀、37.0mM碳酸氫鈉、1.25mM丙酮酸鈉、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白、10mM咖啡因、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、10umoL/L α-硫辛酸、25μg/ml葉酸、3mg/ml谷氨酸鈉的水溶液，

所述冷凍液的組成為：PBS+20%FBS+1.8mol/L乙二醇+0.25mol/L蔗糖+0.2%右旋糖酐40+5mmol/L乙酰半胱氨酸，

所述解凍液的組成為：PBS+20%FBS+0.25mol/L蔗糖+0.2%右旋糖酐40+5mmol/L乙酰半胱氨酸。

2.根據權利要求1的方法，其中所述卵丘-卵母細胞復合體是通過如下方法采集和體外成熟的：

a)離體采集：取屠宰場所得牛卵巢，抽取表面2-8mm的卵泡，收集沉淀，在體視顯微鏡下撿出至少含有3層卵丘細胞包裹的卵母細胞COCs即卵丘-卵母細胞復合體，放入包含HEPES的運輸培養液中38.8℃、無二氧化碳供應、24h內運回實驗室；

b)將以上離體采集所得COCs在卵母細胞成熟培養液中洗滌1次，再轉移到新的成熟培養液中培養22-24h，培養條件為38.8℃、5.5-6.5% CO₂、飽和濕度，得到成熟的卵丘-卵母細胞復合體。