[發明專利]靶向β-珠蛋白基因的gRNA分子，其合成方法和修正突變類型的方法

在審

• 申請號: 202110493308.4
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113430195A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 曾勝;陳鑫蘋;楊宗繁;豐玫玫;王燁
• 申請（專利權）人: 海南蘇生生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/864;C12N15/90
• 代理公司: 廣州幫專高智知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 44674
• 代理人: 陸茵

本申請公開了一種靶向β?珠蛋白基因的內含子I或內含子II的gRNA分子，其合成方法，一種構建靶向β?珠蛋白基因突變位點的修復系統的方法，一種修復系統，以及一種修正β?地中海貧血中β?珠蛋白基因突變類型的通用方法。特別是，所述通用方法能夠修正HSPC中大多數類型的HBB基因突變，并且靶向的HSPC在體外具有正常功能且沒有明顯的脫靶效應。

技術領域

本申請涉及生物技術領域，尤其涉及一種靶向β-珠蛋白基因的內含子I或內 含子II的gRNA分子，其合成方法，一種構建靶向β-珠蛋白基因突變位點的修 復系統的方法，一種修復系統，以及一種修正β-地中海貧血中β-珠蛋白基因突 變類型的通用方法。

背景技術

眾所周知，β地中海貧血(簡稱β地貧)是由β珠蛋白(HBB)基因中200 多種不同類型的突變引起的[1]。通常，HBB與α-球蛋白(HBA)一對一配對以 形成四聚體血紅蛋白分子，并且由于HBB產量不足，未配對的α-球蛋白鏈發生 沉淀，從而導致正在發育的紅細胞或紅細胞前體發生中毒死亡，并造成成熟紅細 胞(RBC)的形成不足[2]。失效的紅細胞生成會導致貧血，如果不及時治療， 那么，嚴重的貧血可以導致較高的死亡率或縮短預期壽命。β地中海貧血影響了 全世界數以百萬計的人，全世界大約每1,000個新出生的嬰兒就有3個患上了嚴 重的β地中海貧血[1，3]。

唯一有效的治療β地中海貧血的方法為同種異體造血干細胞移植 (allo-HSCT)。然而，由于缺乏免疫學上匹配的供體和移植物抗宿主病，該方法 的推廣使用受到限制，因而存在局限性[4]。近幾十年來，科學家們研發出了另 一種基因療法來治療β地中海貧血，而這種方法依靠攜帶功能性HBB基因的插 入基因組的慢病毒載體，將其永久插入自體造血干細胞和祖細胞(HSPC)的基 因組中，它將在骨髓(BM)移植后回到患者的骨髓中，分化為紅細胞并表達高 水平的添加的HBB基因[5，6]。雖然已經進行了許多臨床試驗以確定使用β地中海貧血慢病毒載體進行基因治療的功效和風險之間的平衡，慢病毒載體的“半 隨機”整合性質始終是潛在的風險[7-9]。目前的研究已經通過HBB突變的同源 性定向修復(HDR)實現了精確的基因組編輯。與基于病毒載體的基因轉移方 法不同，該方法可以保留內源性啟動子和調控基因表達以介導時空基因表達[10， 11]。

HDR基因組編輯是對基因組核苷酸序列的精確修飾，它需要工程核酸酶在 特定基因組位點產生DNA雙鏈斷裂(DSB)，并需要DNA供體模板通過“復制 和粘貼”機制來修復受損位點[12]。Cas9核酸酶可在單個向導RNA(gRNA)的 指導下進行編程，以快速的迭代和優化來切割基因組內的目標基因座[13]。近期 的研究表明，通過將CRISPR/Cas9與通過單鏈寡核苷酸(ssODN)[14，15]或血 清型6的重組腺相關病毒載體(rAAV6)遞送的外源HR供體結合，HSPC中HBB 基因外顯子1的鐮狀細胞病(SCD)點突變進行有效地靶向整合，其在體外顯示 出非常陽性的結果，特別是對于rAAV6 HDR供體，其可達到平均29％的HDR 效率[16]。

然而，之前的研究關注特定的突變，例如HBB基因外顯子1上的SCD基因 座，修正各種HBB突變對未來的臨床應用更為有益[17，18]。因此，亟需研發 出一種通用的策略，用于通過經過驗證的CRISPR向導RNA和一種用于HDR 的DNA供體模板來修正大多數類型的HBB突變。

發明內容

本申請的實施方案利用rAAV6載體結合CRISPR/Cas9介導的基因編輯來成 功實現對各種類型的突變β-珠蛋白基因的修復。本申請的技術方案使用來自健康 捐助者的臍帶血HSPC，并且測試rAAV載體，從而通過優化包含Cas9蛋白和 修飾的單鏈向導RNA的核糖核蛋白(RNP)復合物以及rAAV6供體的設計和傳 遞參數來實現高效的靶向整合。進一步地，通過甲基纖維素菌落測定，CFU測 定等評估在體外編輯的HSPC功能。結果表明，修正后的HSPC在體外顯示出正 常的多系形成，并且沒有發生脫靶突變，這意味著該策略展示了一種修正β地中 海貧血中大多數類型的HBB基因突變的通用方法。