[發明專利]靶向β-珠蛋白基因的gRNA分子，其合成方法和修正突變類型的方法

在審

• 申請號: 202110493308.4
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113430195A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 曾勝;陳鑫蘋;楊宗繁;豐玫玫;王燁
• 申請（專利權）人: 海南蘇生生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/864;C12N15/90
• 代理公司: 廣州幫專高智知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 44674
• 代理人: 陸茵

1.一種靶向β-珠蛋白基因的內含子I或內含子II的gRNA分子，其特征在于，所述gRNA分子選自gRNA I-1，gRNA I-2，gRNA I-3，gRNA II-1，gRNA II-2和gRNA II-3；

gRNA I-1的序列如SEQ ID NO：1所示，gRNA I-2的序列如SEQ ID NO：2所示，gRNA I-3的序列如SEQ ID NO：3所示，gRNA II-1的序列如SEQ ID NO：4所示，gRNA II-2的序列如SEQID NO：5所示，以及gRNA II-3的序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根據權利要求1所述的gRNA分子，其特征在于，所述gRNA分子是靶向β-珠蛋白基因的內含子II的gRNA II-2或gRNA II-3。

3.一種根據權利要求1或2所述的gRNA分子的合成方法，其特征在于，用于體外轉錄的gRNA分子模板是通過使用引物對和高保真酶從gRNA載體獲得的PCR產物，所述引物對為引物T7-F和引物T7-R，其中，所述引物T7-F的序列為SEQ ID NO：7，而所述引物T7-R的序列為SEQ ID NO：8。

4.一種構建靶向β-珠蛋白基因突變位點的修復系統的方法，包括以下步驟：

步驟S1：合成Cas9/gRNA RNP；

步驟S2：進行細胞的電轉染；

步驟S3：在各種MOI(感染復數)下添加AAV6供體載體后，對電轉染的細胞進行孵育；

步驟S4：培養孵育的細胞；

其中，gRNA選自gRNA I-1，gRNA I-2，gRNA I-3，gRNA II-1，gRNA II-2和gRNA II-3；

gRNA I-1的序列如SEQ ID NO：1所示，gRNA I-2的序列如SEQ ID NO：2所示，gRNA I-3的序列如SEQ ID NO：3所示，gRNA II-1的序列如SEQ ID NO：4所示，gRNA II-2的序列如SEQID NO：5所示，以及gRNA II-3的序列如SEQ ID NO：6所示。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，Cas9/gRNA RNP是通過在室溫下以1：2.5的摩爾比將Cas9蛋白與gRNA復合而制備的。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟S2中的細胞為造血干細胞和祖細胞(CD34+HSPC)。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步驟S3中，將電轉染的細胞在37℃下孵育。

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步驟S3中，MOI的范圍為1×10³到1×10⁶，優選為1×10⁵。

9.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步驟S4中，在37℃和5％CO₂的條件下培養孵育的細胞。

10.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步驟S1之前，gRNA的體外轉錄包括：

將gRNA克隆到pUC57-T7載體中(Addgene ID：51306)；

接著進行測序分析，以選擇包含靶位點序列的正確gRNA；其中，用于體外轉錄的gRNA模板是通過使用引物對和高保真酶從gRNA載體獲得的PCR產物，所述引物對為引物T7-F和引物T7-R，其中，所述引物T7-F的序列為SEQ ID NO：7，而所述引物T7-R的序列為SEQ ID NO：8；

然后，使用T7高產RNA合成試劑盒轉錄gRNA，并使用miRNeasy Mini試劑盒進行純化；

使用NotI將Cas9表達載體線性化，并使用mMESSAGE mMACHINE SP6試劑盒轉錄，以生成帶帽的Cas9 RNA。