[發明專利]一種表達病毒樣顆粒的細胞核轉化的轉基因植物的制備方法及其在抵抗棉鈴蟲中的應用

有效

• 申請號: 202110491857.8
• 申請日: 2021-05-06
• 公開（公告）號: CN113061623B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發明（設計）人: 張江;任康;姜春妹;付金秋;常玲
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/113;C12N15/40;A01H5/12;A01H6/82
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 藍曉玉

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種表達病毒樣顆粒的細胞核轉化的轉基因植物的制備方法及其在抵抗棉鈴蟲中的應用。本發明中構建煙草表達載體，成功檢測到MS2噬菌體衣殼蛋白在煙草中高效表達，并檢測hpRNA的表達，選取表達量最高的煙草株系。其次建立成熟的棉鈴蟲飼養體系，在此基礎上進行棉鈴蟲生理測試。本發明的技術方案有效地提高的植物對棉鈴蟲的抗性，抑制了棉鈴蟲的生長以及化蛹，目的基因Ace1在處理組顯著性下調，說明病毒樣顆粒介導的RNAi的成功應用可以有效提高植物對棉鈴蟲的抗性。通過VLP介導的RNAi分子遞送技術在植物中的成功應用為棉鈴蟲的防治奠定了堅實的基礎，為棉鈴蟲的防控提供了一種有效的途徑。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種表達病毒樣顆粒的細胞核轉化的轉基因植物的制備方法及其在抵抗棉鈴蟲中的應用。

背景技術

棉鈴蟲是我國最重要的農業害蟲之一，也是世界性害蟲，危害的植物多達200余種，使用蘇云金芽孢桿菌(Bt)來防治棉鈴蟲被認為是一種環境友好的防治方法，得到了廣泛的應用。但是隨著其廣泛種植也帶來了新的問題，例如棉鈴蟲對Bt出現抗性、次要害蟲變成主要害蟲、棉鈴蟲的進化加速等等。近些年發展起來的RNAi的抗蟲技術有著序列專一性高，環境友好的優點，為害蟲的治理提供了新的思路和方向。

RNAi是一種在真核生物中由dsRNA誘發的基因沉默現象，由核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成21-24nt的siRNA，接著siRNA與體內的一些AGO蛋白酶形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，進而對互補的mRNA進行切割，導致mRNA的降解，誘發基因的沉默。在害蟲防治領域，RNAi技術通過抑制害蟲關鍵基因的表達，從而影響害蟲生長或者殺死害蟲。該技術具有序列特異性，針對特定的靶位點，對作物和人畜無害，具有較大的應用潛力。

過去10來年中，利用植物介導的RNAi技術在害蟲防治方面取得了令人矚目的成就。最早的報道：Mao等用表達P450基因RNAi分子的煙草和棉花飼喂棉鈴蟲后，棉鈴蟲腸道中P450基因的表達顯著降低，從而抑制了棉鈴蟲的取食和生長發育。進一步研究表明同時在棉花中另外轉入半胱氨酸蛋白酶基因能夠進一步提高RNAi的抗蟲效果；Baum等對玉米進行基因改造，使其表達以玉米根螢葉甲(Diabroticavirgifera virgifera Leconte)的液泡ATP酶的A亞基基因為靶標的RNAi分子，結果表明，取食經過基因改良的玉米能夠抑制害蟲腸道細胞靶標基因的表達，經過基因改良的玉米根部遭受的破壞要比野生型玉米的少50％；通過植物介導的RNAi抗棉鈴蟲的研究中，不同課題組也報道了針對不同的靶標基因，可以抑制相應基因的表達，轉基因植物對棉鈴蟲具有一定程度的抗性；另外，Ni等報道了通過在棉花中聚合RNAi與Bt能夠進一步提高植物的抗蟲性并延緩棉鈴蟲對Bt抗性的進化速度。通過植物介導的RNAi對刺吸式口器害蟲也有成功的報道，如Pitino等用含有唾液腺MpC002基因和腸道Rack1基因表達的dsRNA的轉基因植物喂食桃蚜，發現60％以上桃蚜的目標基因表達受抑制，同時其后代數量明顯減少。Zha等證明了RNA干擾抗蟲同樣能夠用在抗刺吸式昆蟲---水稻褐飛虱上，取食表達RNAi分子的水稻能夠抑制對應基因的表達；王暉等用細胞色素P450基因表達的dsRNA喂食麥長管蚜與桃蚜，成功抑制了蚜蟲體內的細胞色素表達，最終導致蚜蟲死亡。

盡管植物核轉基因介導的RNAi技術在蟲害治理方面取得了令人矚目的成就，但是其抗蟲效果相對于利用Bt作物抗蟲不太理想。其可能的原因在于：①由于昆蟲缺少RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)，RNAi抗蟲效果將取決于吸收dsRNA劑量，然而通過細胞核轉化表達的dsRNA量不夠高，不足以引起目標害蟲顯著的RNAi反應。②由于植物自身具有RNAi途徑，植物中表達的dsRNA會被植物本身的Dicer加工成siRNA，而植物產生的siRNA對抗蟲的效果不佳。因而整體上降低了抗蟲效果。因此，提高殺蟲dsRNA在植物的表達水平，并提高其在植物中的穩定性，將是有效提高抗蟲效果的一種策略。

綜上所述，現有技術存在的問題是：