[發(fā)明專利]一種用于短鏈非編碼RNA檢測的模塊化酶電路檢測系統(tǒng)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110491225.1
• 申請(qǐng)日: 2021-05-06
• 公開（公告）號(hào): CN113462755B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高銘萱;包靜;楊成;周洋;王映然;王小;陳鳴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844;C12Q1/6806;G01N21/64
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 任葦

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種用于短鏈非編碼RNA檢測的模塊化酶電路檢測系統(tǒng)，包括識(shí)別模塊、擴(kuò)增模塊和信號(hào)輸出模塊。本發(fā)明將酶作為反應(yīng)體系的核心，把具有不同功能的酶進(jìn)行組合使其能夠成為具有特定功能的內(nèi)聚化酶基模塊，簡化了核酸序列以及結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，針對(duì)不同靶物對(duì)象，僅需要對(duì)結(jié)構(gòu)核酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，即可實(shí)現(xiàn)檢測，降低了干擾，并實(shí)現(xiàn)了更加高效的檢測，實(shí)現(xiàn)對(duì)極低濃度的ncRNA的高特異性高靈敏度檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于短鏈非編碼RNA檢測的模塊化酶電路檢測系統(tǒng)。

背景技術(shù)

短鏈非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)能在細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用并影響受體細(xì)胞蛋白表達(dá)，但由于其在早期篩查中含量低而不易檢測，因此將微弱的ncRNA樣品信息(拷貝數(shù)或濃度)轉(zhuǎn)換成為可以被充分且準(zhǔn)確識(shí)別的信息(光學(xué)或電學(xué)信號(hào))是實(shí)現(xiàn)對(duì)其有效檢測的關(guān)鍵點(diǎn)。酶參與的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可將待測靶物進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)超靈敏的檢測。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以熵驅(qū)動(dòng)的鏈置換反應(yīng)對(duì)病毒RNA進(jìn)行檢測，需要借助單分子熒光顯微鏡等大型設(shè)備才能達(dá)到現(xiàn)有技術(shù)中的檢測效果，由此可見酶參與的核酸擴(kuò)增技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)媲美大型儀器的超靈敏檢測，更有利于床邊檢測技術(shù)(POCT)的發(fā)展。在常規(guī)的酶參與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，酶通常是配合復(fù)雜的核酸設(shè)計(jì)以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)檢測，這類檢測方法一般是將核酸作為控制發(fā)生的“核心機(jī)構(gòu)”，以熵驅(qū)動(dòng)的鏈置換反應(yīng)作為啟動(dòng)下一步反應(yīng)的控制器，通過調(diào)控核酸序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及空間排布從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)靶物的分析檢測，其主要的技術(shù)瓶頸在于：①由于核酸序列環(huán)環(huán)相扣，各步反應(yīng)間的耦合程度極高，這會(huì)導(dǎo)致整體反應(yīng)體系尤為復(fù)雜且易被污染；②在針對(duì)多重檢測靶物時(shí)，對(duì)堿基互補(bǔ)以及核酸結(jié)構(gòu)的過度依賴會(huì)導(dǎo)致設(shè)計(jì)難度成倍增加。

現(xiàn)有的基于DNA分子電路的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)通常依靠核酸序列的反復(fù)利用，甚至是參與多個(gè)循環(huán)步驟，從而提高靈敏度。在這一類的設(shè)計(jì)中，由于核酸同時(shí)參與多步反應(yīng)，致使整個(gè)檢測體系耦合程度極高，任何一個(gè)環(huán)節(jié)中的核酸產(chǎn)生不正確的雜交或者擴(kuò)增，都會(huì)導(dǎo)致整個(gè)檢測系統(tǒng)的崩潰，如果對(duì)不正確的核酸序列進(jìn)行調(diào)整，又將相應(yīng)的修改整個(gè)反應(yīng)體系。

因此，發(fā)明人從另一個(gè)角度出發(fā)，將酶作為反應(yīng)體系的核心，把具有不同功能的酶進(jìn)行組合使其能夠成為具有特定功能的內(nèi)聚化酶基模塊，發(fā)明了一種用于短鏈非編碼RNA檢測的模塊化酶電路檢測系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

基于以上問題，本發(fā)明提供一種用于短鏈非編碼RNA檢測的模塊化酶電路檢測系統(tǒng)，本發(fā)明將酶作為反應(yīng)體系的核心，把具有不同功能的酶進(jìn)行組合使其能夠成為具有特定功能的內(nèi)聚化酶基模塊，簡化了核酸序列以及結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，降低了干擾，并實(shí)現(xiàn)了更加高效的檢測。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于短鏈非編碼RNA檢測的模塊化酶電路檢測系統(tǒng)，包括識(shí)別模塊、擴(kuò)增模塊和信號(hào)輸出模塊；

識(shí)別模塊包括II反轉(zhuǎn)錄酶、Nt.AlwI酶和SL-MB引物，SL-MB引物的核苷酸序列見SEQ ID No.1，II反轉(zhuǎn)錄酶將與SL-MB引物結(jié)合的待測靶物短鏈非編碼RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Nt.AlwI酶通過識(shí)別切刻位點(diǎn)5’-GGATCNNNN-3’將完成逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA剪切，從而得到第一段接口核酸initiator；

擴(kuò)增模塊包括DNA聚合酶、Nt.AlwI酶和sub1引物，sub1引物的核苷酸序列見SEQ ID No.2，sub1引物與第一段接口核酸initiator雜交結(jié)合，之后DNA聚合酶沿sub1引物對(duì)initiator序列進(jìn)行聚合，得擴(kuò)增序列，Nt.AlwI酶通過識(shí)別切刻位點(diǎn)5’-GGATCNNNN-3’剪切擴(kuò)增序列，得到與initiator序列一致的第二段接口核酸initiator*，由于initiator*與initiator序列一致，因此initiator*可以再次與sub1引物雜交結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增；