[發明專利]一種用于短鏈非編碼RNA檢測的模塊化酶電路檢測系統

有效

• 申請號: 202110491225.1
• 申請日: 2021-05-06
• 公開（公告）號: CN113462755B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 高銘萱;包靜;楊成;周洋;王映然;王小;陳鳴
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6806;G01N21/64
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 任葦

1.一種用于短鏈非編碼RNA檢測的模塊化酶電路檢測系統，其特征在于，包括識別模塊、擴增模塊和信號輸出模塊；

識別模塊包括Protoscript II反轉錄酶、Nt.AlwI酶和SL-MB引物，SL-MB引物的核苷酸序列見SEQ ID No.1，Protoscript II反轉錄酶將與SL-MB引物結合的待測靶物短鏈非編碼RNA逆轉錄為cDNA，Nt.AlwI酶通過識別切刻位點5’-GGATCNNNN-3’將完成逆轉錄后的cDNA剪切，從而得到第一段接口核酸initiator；

擴增模塊包括Vent DNA聚合酶、Nt.AlwI酶和sub1引物，sub1引物的核苷酸序列見SEQID No.2，sub1引物與第一段接口核酸initiator雜交結合，之后Vent DNA聚合酶沿sub1引物對initiator序列進行聚合，得擴增序列，Nt.AlwI酶通過識別切刻位點5’-GGATCNNNN-3’剪切擴增序列，得到與initiator序列一致的第二段接口核酸initiator*，由于initiator*與initiator序列一致，因此initiator*能夠再次與sub1引物雜交結合，從而實現指數擴增；

信號輸出模塊包括UDG酶、核酸內切酶IV和sub2引物，sub2引物的核苷酸序列見SEQ IDNo.3，sub2引物的5’端修飾BHQ-1，sub2引物的5’端第六個堿基為dU，第八個堿基為修飾HEX的dT；擴增模塊中得到的大量initiator*序列能夠與sub2引物序列結合，此時UDG酶將sub2引物序列中的脫氧尿嘧啶中的嘧啶環剪切除去形成糖基化位點，核酸內切酶IV進一步將糖基化位點進行剪切，從而截斷sub2引物序列，使HEX熒光分子遠離BHQ-1熒光猝滅分子，最終實現熒光信號的輸出，完成檢測。

2.根據權利要求1所述的模塊化酶電路檢測系統，其特征在于，所述短鏈非編碼RNA為miR-10b，檢測系統的反應體系為20uL，反應體系具體如下：在200uL EP管內依次加入9.2uL超純水、2uL緩沖液，0.6uL 100mM硫酸鎂，1uL10uM SL-MB引物，1uL 10uM sub1引物，1uL10uM sub2引物，0.4uL 10mM dNTPs，1.2uL 500ug/mL ET SSB，0.4uL 20U/uLRNA酶抑制劑，0.4uL 200U/uL Protoscript II反轉錄酶，0.4uL 2U/uLVent DNA聚合酶，0.6uL 10U/uLNt.AlwI酶，0.4uL 5U/uLUDG酶以及0.4uL 10U/uL核酸內切酶IV，最后加入1uL 5nM或50pM或0.5pM或5fM或50aM的miR-10b；上述緩沖液內含有20mM Tris-醋酸、10mM醋酸鎂、50mM醋酸鉀、100ug/mLBSA，pH7.9@25℃；利用漩渦混勻儀將上述反應體系混勻后，于10000rpm條件下離心5s，然后于55℃溫度條件下反應1h，期間每隔15s監測一次反應的熒光強度，檢測的激發波長為521nm，發射波長為536nm；通過對比熒光-時間曲線一階導數中的極值點，判斷對應的miR-10b濃度下的反應時間，并建立反應濃度對反應時間的數學關系，實現對miR-10b的超靈敏定量檢測。