[發明專利]一種RNA文庫的構建方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202110490894.7
• 申請日: 2021-05-06
• 公開（公告）號: CN113201793A
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 方圓;蔡青青;宋澤世
• 申請（專利權）人: 探因醫學科技（浙江）有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/6806
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本申請屬于基因檢測技術領域，具體公開一種RNA文庫的構建方法，包括如下步驟：采用第一引物逆轉錄RNA，得到第一鏈cDNA，所述第一引物包括第一接頭序列和隨機序列；純化所述第一鏈cDNA；采用第二引物擴增所述第一鏈cDNA，生成二鏈DNA，所述第二引物包括第二接頭序列和隨機序列；采用第三引物擴增所述二鏈DNA得到RNA文庫。本申請至少具有以下有益效果之一：本申請提供的RNA文庫的構建方法，以完整的RNA鏈為模板進行逆轉錄，無需將RNA進行片段化，引物上直接連接有接頭序列，無需后期再進行雙端接頭連接，而且該方法僅需要帶有雙端接頭的單鏈，因此無論是擴增效率還是建庫速度都大幅提升。

技術領域

本申請屬于基因測序技術領域，更具體地說，它涉及一種RNA文庫的構建方法及試劑盒。

背景技術

轉錄組測序技術，RNA-seq是研究生物基因表達的重要工具，該技術廣泛應用于不同物種的基因表達圖譜分析中。近年來出現的RNA-seq建庫試劑盒主要側重于RNA鏈特異性研究，文庫建庫過程需要提取總RNA，富集mRNA，通過逆轉錄合成第一鏈cDNA，使用dUTP合成第二鏈cDNA，隨后進行雙鏈cDNA的末端補平、加腺嘌呤A堿基再進行接頭連接，消化含尿嘧啶U堿基的cDNA后通過PCR擴增完成建庫。

其具體的建庫過程如下：

(1)片段化RNA，添加dUTP合成雙鏈cDNA，通過尿嘧啶U堿基區分鏈特異性；

(2)對cDNA進行末端補平修復及對cDNA的3’端加腺嘌呤A堿基，保證cDNA雙鏈的3’端含有A堿基懸掛進而配合接頭的3’端胸腺嘧啶T堿基實現TA連接完成建庫；

(3)需要設計兩條單鏈接頭并退火形成雙鏈，且含有硫代硫酸酯鍵修飾，保證接頭T堿基不會脫落，才能進行有效接頭連接；

(4)最后，在進行PCR之前還需對含有尿嘧啶U堿基的cDNA第二鏈進行消化才能實現鏈特異性建庫。

由于現有的流程需要先進行RNA打斷至小片段，再生成雙鏈cDNA后，最后進行雙鏈的補平，加A，連接接頭、擴增建庫等步驟，所以流程較長，通常需要7~9個小時才能完成試驗，建庫效率低。

發明內容

為了提高建庫效率，本申請提供一種RNA文庫的構建方法，該方法能夠簡化建庫的路程，通過兩輪帶有接頭序列的cDNA的合成，同步完成模板的逆轉錄和雙端接頭序列的引入，并完成模板的富集，實現了快速高效的建庫。

本申請是通過以下方案實現的：

本申請提供了一種RNA文庫的構建方法，包括如下步驟：

采用第一引物逆轉錄總RNA，得到第一鏈cDNA，所述第一引物包括第一接頭序列和隨機序列；

純化所述第一鏈cDNA；

采用第二引物擴增所述第一鏈cDNA，生成二鏈DNA，所述第二引物包括第二接頭序列和隨機序列；

采用第三引物擴增所述二鏈DNA得到RNA文庫。

本申請通過對完整的cDNA模板進行逆轉錄，由于第一引物中的隨機序列可以和模板進行多點的結合，獲得了高于原始模板產量的cDNA，且由于引物結合位點的隨機性，每一條產物都具有不同的序列。

本申請中，通過純化第一鏈cDNA去掉殘留的接頭序列，以減少后續非特異性擴增，減少二聚體的產生。

在本申請的一個具體實施方式中，所述第二引物擴增所述第一鏈cDNA時采用具有鏈置換功能的DNA聚合酶。

本申請中，合成二鏈DNA時，由于DNA聚合酶具有高效的鏈置換活性，因此，一條cDNA鏈可以合成多條不同長度的二鏈DNA，且產物帶有雙端接頭序列，無需再進行接頭連接。

在本申請的一個具體實施方式中，所述DNA聚合酶為phi29 酶。

本申請中，由于隨機序列的結合效率和模板長度呈正相關性，因此，不打斷的RNA可以產生更多的目的片段。