[發明專利]一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法

在審

• 申請號: 202110483747.7
• 申請日: 2021-04-30
• 公開（公告）號: CN112980691A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 姚晨虓;李小杰;李成軍;劉暢;陳玉國;白靜科;邱睿;康業斌;李淑君;孫迪;湯玲玲;雷晶晶
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院煙草研究所
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12Q1/18
• 代理公司: 鄭州意創知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 41138
• 代理人: 張江森;張燕紅

1.一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）采用梯度稀釋法從根際土壤樣品或其他供試材料中分離獲得細菌菌株，用劃線純化法對分離獲得的菌株進行純化，獲得純培養，并于4℃保存備用；

（2）采用點接法和平板對峙培養法相結合，將培養好的細菌菌種對植物病原菌進行初篩，以獲得具有明顯抑制效果的拮抗細菌；

（3）將初篩得到的拮抗菌株進行液體發酵培養，然后采用改良的平板對峙培養法和十字定位法，用移液槍吸取5μL發酵液，點在距離中心2.5 cm的對稱四點的培養基上，中心位置接種植物病原真菌的5 mm菌柄，在特定的培養條件下對峙培養，測量菌落半徑和抑菌帶的大小，將最終篩選獲得的拮抗細菌菌株保存在滅菌的50%甘油中，-80 ℃長久保存用。

2.根據權利要求1所述的一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法，其特征在于：所述的步驟（1）中的采用梯度稀釋法從根際土壤樣品或其他供試材料中分離獲得細菌菌株，指的是：將采回的根際土壤樣品平鋪于室內陰涼處風干，并挑出殘根、石塊等雜物，風干土樣研磨后用10目的篩子過篩，用四分法收集土壤樣品，稱取土樣10g，加入已盛有90mL無菌水的250mL錐形瓶中，向瓶中加入滅菌后的玻璃珠，封口放置在搖床上180 r/min，30 min，使土樣中菌體、芽孢、孢子均勻分散，然后靜置30-40s，取上清液分別稀釋至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的土壤懸浮液。

3.根據權利要求1所述的一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法，其特征在于：所述的步驟（1）中對分離的菌株進行純化，指的是取100μL的10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀釋液均勻涂布在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上培養細菌菌落，每濃度做3次重復，25 ℃倒置培養1-3 d，挑出平板中菌落形態與顏色不同的單菌落進行純化培養，并在4 ℃保存備用。

4.根據權利要求1所述的一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法，其特征在于：所述的步驟（2）中將培養好的細菌菌種對植物病原菌進行初篩，指的是，以植物病原菌為靶標，采用平板對峙培養法和點接法選取培養好的病原菌菌落，用直徑為5mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉接至病原菌的特定平板中央，用滅菌牙簽分別將分離純化獲得的不同細菌菌株接種到距離病原真菌2.5cm等距的4個點上，注意接種時盡量保證接種量一致，與病原菌對峙培養，以不接細菌只接病原菌為對照，重復3次，正置放入25℃恒溫箱培養至病原菌對照組菌落長至7.0±0.5 cm時，測量菌絲半徑，計算抑制率。

5.根據權利要求1所述的一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法，其特征在于：所述的步驟（3）中的十字定位法，指的是提前在超凈工作臺上用記號筆畫上兩條長為5cm垂直平分的線段，使其均分為等距的2.5cm的四個線段或者只接點上離中心等距2.5cm的均勻分布的4個點，直接將倒好的平板放置于定位點上方，調整至合適的位置，然后接種拮抗細菌菌液和病原菌菌餅即可，待實驗結束后只需用酒精輕輕擦拭桌面即可恢復原貌。