[發(fā)明專利]一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110483747.7
• 申請日: 2021-04-30
• 公開（公告）號: CN112980691A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姚晨虓;李小杰;李成軍;劉暢;陳玉國;白靜科;邱睿;康業(yè)斌;李淑君;孫迪;湯玲玲;雷晶晶
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12Q1/18
• 代理公司: 鄭州意創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 41138
• 代理人: 張江森;張燕紅

一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法，包括以下步驟：采用梯度稀釋法從根際土壤樣品或其他供試材料中分離獲得細菌菌株，用劃線純化法對分離獲得的菌株進行純化，獲得純培養(yǎng)；采用點接法和平板對峙培養(yǎng)法相結(jié)合，將培養(yǎng)好的細菌菌種對植物病原菌進行初篩，以獲得具有明顯抑制效果的拮抗細菌；將初篩得到的拮抗菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，然后采用改良的平板對峙培養(yǎng)法和十字定位法，在特定的培養(yǎng)條件下對峙培養(yǎng)，測量菌落半徑和抑菌帶的大小；本發(fā)明操作簡單，方法簡便，極大減少了工作量，縮短了篩選拮抗菌的時間，提高了篩選效率，同時保證了篩選結(jié)果的準確性，與其他現(xiàn)有的方法相比省時省力且更準確。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法。

背景技術(shù)

生物防治逐漸成為近年來田間病蟲害防治的重要手段和研究熱點之一，尤其是對于常見田間病害的防治，微生物菌劑的研究與應用成為熱門。因此，從田間土壤或者其它供試材料中分離、純化、篩選、鑒定出對供試病原菌具有較好拮抗作用的拮抗菌株是必不可少的步驟，但是從分離純化，尤其是大量的篩選過程工作量之巨大，費時費力，往往還會產(chǎn)生一定的誤差。

用于植物病害生物防治的生防因子有很多，其中以生防菌株的研究與應用最為廣泛，效果最好。拮抗細菌在植物病害防治中發(fā)揮了非常重要的作用，篩選和應用拮抗細菌是當前植物病害防治領(lǐng)域研究的熱點之一。其中，被開發(fā)作為生物農(nóng)藥的細菌菌株主要集中于芽孢桿菌（Bacillus sp.）和假單孢菌（Pseudomonas sp.)、土壤桿菌（Agrobacteriumsp.）等，且對病原真菌、病原細菌、病原線蟲都具有較好的拮抗效果，包括煙草、小麥、水稻、蔬菜、棉花、花卉等多種作物病害。

但是關(guān)于拮抗細菌的前期分離篩選工作量十分巨大，現(xiàn)有的篩選方法是平板對峙培養(yǎng)法，如KB藥敏實驗法（也叫濾紙片法），牛津杯法,改良的平板對峙培養(yǎng)法，高通量48孔細胞培養(yǎng)板法。定位的方法多是提前在培養(yǎng)皿上用記號筆標記，或者也有技術(shù)發(fā)明，如定位盤。工作費時費力，有時還會存在一定的誤差，不夠準確；定位盤的使用也不太方便，不能較好的解決問題。

公開號為CN103013884A的專利 “一種從堆肥中快速、高效篩選拮抗細菌的方法”。該發(fā)明先將堆肥懸浮液涂布于平板后，再直接在平板上涂布致病菌菌液，使目標細菌與致病菌直接對峙，待形成抑菌圈后，從抑菌圈內(nèi)將混合的目標細菌進行劃線純化，純化后再挑取單個目標細菌進行平板對峙，從而篩選出拮抗細菌。一定程度上減少了分離篩選的工作量，但是后續(xù)挑取單個目標菌株可能不純，純化拮抗細菌也較為麻煩，甚至不容易得到具有較好抑制效果的原始目標菌株。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種快速準確篩選植物病原真菌拮抗細菌菌株的方法，包括以下步驟：

（1）采用梯度稀釋法從根際土壤樣品或其他供試材料中分離獲得細菌菌株，用劃線純化法對分離獲得的菌株進行純化，獲得純培養(yǎng)，并于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）采用點接法和平板對峙培養(yǎng)法相結(jié)合，將培養(yǎng)好的細菌菌種對植物病原菌進行初篩，以獲得具有明顯抑制效果的拮抗細菌；

（3）將初篩得到的拮抗菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，然后采用改良的平板對峙培養(yǎng)法和十字定位法，用移液槍吸取5μL發(fā)酵液，點在距離中心2.5 cm的對稱四點的培養(yǎng)基上，中心位置接種植物病原真菌的5 mm菌柄，在特定的培養(yǎng)條件下對峙培養(yǎng)，測量菌落半徑和抑菌帶的大小，將最終篩選獲得的拮抗細菌菌株保存在滅菌的50%甘油中，-80 ℃長久保存用。