[發明專利]肝臟類器官的制備方法

有效

• 申請號: 202110481017.3
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN113388569B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 高毅;易笑;陳楓;李陽;王沂峰;劉凡;郜坤潔
• 申請（專利權）人: 廣東乾暉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京市立方律師事務所 11330
• 代理人: 劉延喜

本申請公開一種肝臟類器官的制備方法，包括以下步驟：將脫細胞基質水凝膠、干細胞和肝臟細胞用無血清培養基混合均勻；在培養容器中靜置培養至所述脫細胞基質水凝膠凝固；確定凝固后的所述脫細胞基質水凝膠中的細胞存活之后繼續培養，獲得肝臟類器官。通過本申請的方法所制備的肝臟類器官，其具有超低免疫源性，有跨物種移植的可能性。

本申請為專利申請“臍帶間充質干細胞重編程為肝臟細胞的方法及所制備的肝臟類器官”的分案申請，原申請的申請日為2020年8月28日，申請號為2020108879718，公開號為CN 112111444 A。

技術領域

本申請涉及一種細胞培養技術，尤其涉及一種肝臟類器官的制備方法。

背景技術

肝腫瘤通常需要進行肝臟大部分切除術，剩余肝臟將再生代償，術后容易導致肝切除術后肝衰竭(PHLF)，這是最令人擔憂的并發癥之一，必須通過移植和終生免疫抑制來治療。供體肝的短缺，高成本和免疫抑制限制了這種治療方式的使用。肝功能衰竭的治療也可以通過臨時性肝支持方法來改善。比如生物人工肝，通過血漿置換和白蛋白透析進行持續性血液透析濾過可以改善某些肝功能參數，但是尚難以證明其能提高患者生存率。而且由于缺乏安全的肝細胞來源，這項技術受到了限制。肝細胞的潛在替代來源包括豬肝細胞，永生化人類肝細胞，ES細胞衍生的肝細胞和各種成人干細胞，但是仍不能解決現在人工肝治療過程中原代肝細胞缺乏的問題。進一步地，有研究表明，間充質干細胞(MSCs)或MSCs來源的肝細胞樣細胞移植可改善了嚙齒動物或患有肝損傷的患者的肝功能。但是，迄今為止使用的幾種傳統方法收效甚微，這些類肝細胞樣細胞僅表現出一部分標記和原代肝細胞的功能。

發明內容

本申請的目的是，克服現有技術的不足，提供一種簡單、容易重復，重編程效率高，可用于臨床上大量獲取功能性肝臟細胞的臍帶間充質干細胞重編程為肝臟細胞的方法，并利用所獲得的肝臟細胞制備肝臟類器官。

為達到以上技術目的，本申請采用的技術方案如下：

首先是一種臍帶間充質干細胞重編程為肝臟細胞的方法，其包括以下步驟：

獲取臍帶間充質干細胞；

對所述臍帶間充質干細胞進行預處理2d；

利用成肝誘導組合物對經過預處理的臍帶間充質干細胞進行成肝誘導7d；

利用第一成熟誘導組合物對經過成肝誘導處理的臍帶間充質干細胞進行第一次成熟誘導7d，獲得肝臟細胞；

利用第二成熟誘導組合物對所述肝臟細胞進行第二次成熟誘導12～20d，獲得功能性肝臟細胞。

優選地，所述臍帶間充質干細胞進行預處理之前，體外培養至對數生長期。

進一步優選地，所述臍帶間充質干細胞進行預處理之前，在無血清條件下進行體外培養。

具體地，所述預處理的試劑包括20ng/mL的表皮生長因子和10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子；

所述成肝誘導組合物包括30ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子、20ng/mL的肝細胞生長因子和0.61g/L的煙酰胺；

所述第一次成熟誘導組合物包括40ng/mL的ITS Premix的混合劑、10ng/mL的重組人骨保護素-M和1umol/L的地塞米松；

所述第二次成熟誘導組合物包括40ng/mL的ITS+Premix、40ng/mL的重組人骨保護素-M、1umol/L的地塞米松、10umol/L的人源γ分泌酶復合物抑制劑和10umol/L的小分子抑制劑SB431542。

光學顯微鏡下，所述功能性肝臟細胞為不規則圓形或多邊形，核仁邊界清晰。

所述功能性肝臟細胞的肝臟特異性基因表達率高于所述肝臟細胞。