[發明專利]肝臟類器官的制備方法

有效

• 申請號: 202110481017.3
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN113388569B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 高毅;易笑;陳楓;李陽;王沂峰;劉凡;郜坤潔
• 申請（專利權）人: 廣東乾暉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京市立方律師事務所 11330
• 代理人: 劉延喜

1.一種肝臟類器官的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟：

將脫細胞基質水凝膠、干細胞和肝臟細胞用無血清培養基混合均勻，每12ml無血清培養基中加入1×10⁷個干細胞、1×10⁶個肝臟細胞和3ml脫細胞基質水凝膠；所述脫細胞基質水凝膠通過臍帶組織制備，所述干細胞為臍帶間充質干細胞；所述肝臟細胞通過誘導臍帶間充質干細胞分化獲得；

在培養容器中靜置培養至所述脫細胞基質水凝膠凝固；

確定凝固后的所述脫細胞基質水凝膠中的細胞存活之后繼續培養，獲得肝臟類器官；

其中，所述肝臟細胞通過誘導臍帶間充質干細胞分化獲得，包括成肝誘導過程和成熟誘導過程；所述成熟誘導過程包括：

利用第一成熟誘導組合物對經過成肝誘導處理的臍帶間充質干細胞進行第一次成熟誘導7d，獲得肝臟細胞；所述第一次成熟誘導組合物包括40 ng/mL的ITS Premix的混合劑、10 ng/mL的重組人骨保護素-M和1 umol/L的地塞米松；

利用第二成熟誘導組合物對所述肝臟細胞進行第二次成熟誘導12~20d，獲得功能性肝臟細胞；所述第二次成熟誘導組合物包括40 ng/mL的ITS + Premix、40 ng/mL的重組人骨保護素-M、1 umol/L的地塞米松、10 umol/L的人源γ分泌酶復合物抑制劑和10 umol/L的小分子抑制劑SB431542；

所述成肝誘導過程之前，包括：

獲取臍帶間充質干細胞；

對所述臍帶間充質干細胞進行預處理2d；所述預處理的試劑包括20 ng/mL的表皮生長因子和10 ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子；

所述成肝誘導過程包括：利用成肝誘導組合物對經過預處理的臍帶間充質干細胞進行成肝誘導7d；

所述成肝誘導組合物包括30 ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子、20 ng/mL的肝細胞生長因子和0.61g/L的煙酰胺。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述脫細胞基質水凝膠使用前為預凝膠狀態，使用時，用緩沖液配平為液態水凝膠。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述預凝膠在冰上取用。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述液態水凝膠進行混合之前調節pH到7~7.5。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在培養箱內進行所述靜置培養。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過染色法確定所述脫細胞基質水凝膠中的重編程肝臟細胞和正常肝臟細胞存活的情況。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述脫細胞基質水凝膠中的細胞存活之后，繼續培養6~7d，獲得肝臟類器官。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述獲得肝臟類器官之后，將所述肝臟類器官移植到動物體內，當所述肝臟類器官在動物肝臟表面固定且布滿血管，動物無免疫排斥反應，證明所述肝臟類器官移植成功。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述臍帶間充質干細胞進行預處理之前，在無血清條件下進行體外培養，并且體外培養至對數生長期。