[發(fā)明專利]制備過表達(dá)外源基因的細(xì)胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110479724.9
• 申請日: 2021-04-30
• 公開（公告）號: CN113583953A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金華君;許馥慧;黃晨;馬星明
• 申請（專利權(quán)）人: 上海君賽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N1/10
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發(fā)明制備過表達(dá)外源基因的細(xì)胞的方法，具體涉及cGAS?STING信號通路抑制劑在培養(yǎng)電轉(zhuǎn)細(xì)胞中的應(yīng)用、培養(yǎng)電轉(zhuǎn)細(xì)胞的方法、電轉(zhuǎn)制備過表達(dá)外源基因的細(xì)胞的方法以及添加有cGAS?STING信號通路抑制劑的細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明通過使用含有cGAS?STING信號通路抑制劑的培養(yǎng)基對電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞、尤其是免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，能夠明顯地降低電轉(zhuǎn)后細(xì)胞的死亡率，提高細(xì)胞電轉(zhuǎn)后的活細(xì)胞數(shù)量與活細(xì)胞比例。

本申請要求申請?zhí)枮?02010359691.X、申請日為2020.4.30、發(fā)明名稱為“制備過表達(dá)外源基因的細(xì)胞的方法”的中國專利申請的優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及電轉(zhuǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)，具體涉及制備過表達(dá)外源基因的細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

使用表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)的免疫效應(yīng)細(xì)胞，如CAR-T細(xì)胞的過繼性細(xì)胞治療(Adoptive Cell Therapy，ACT)用于治療腫瘤具有永久性改變腫瘤治療現(xiàn)狀的潛力。這類治療依賴于高效、穩(wěn)定和安全的基因轉(zhuǎn)移平臺。將編碼嵌合抗原受體的合成的基因轉(zhuǎn)入免疫效應(yīng)細(xì)胞，如T細(xì)胞內(nèi)，是實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的第一步。基因轉(zhuǎn)移技術(shù)主要包括病毒方法與非病毒方法。病毒方法主要包括使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體來表達(dá)CAR基因，通過包裝的病毒顆粒將CAR基因?qū)朊庖咝?yīng)細(xì)胞內(nèi)，并通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒自身的整合系統(tǒng)整合至細(xì)胞基因組上。病毒載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于病毒顆粒能夠有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞，如T細(xì)胞，并且高效穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞基因組中。但病毒的制備生產(chǎn)過程成本較高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且為了符合臨床安全標(biāo)準(zhǔn)，利用病毒系統(tǒng)改造的免疫效應(yīng)細(xì)胞中需要表現(xiàn)出病毒自身無復(fù)制、低基因毒性以及低免疫源性，在回輸至人體內(nèi)后還需要長期監(jiān)控，存在著一定的安全隱患。

電轉(zhuǎn)(或電穿孔)在醫(yī)學(xué)的部分領(lǐng)域中已經(jīng)是一種成熟的方法，但其在生物技術(shù)中的應(yīng)用才剛剛顯現(xiàn)。通過瞬時(shí)向細(xì)胞或組織施加一定的高電場脈沖，在細(xì)胞膜表面瞬時(shí)形成通透，進(jìn)而導(dǎo)致帶電荷的分子進(jìn)入細(xì)胞。經(jīng)典的電穿孔將導(dǎo)致細(xì)胞的跨膜運(yùn)輸增強(qiáng)，并改變電導(dǎo)率。這一過程在細(xì)胞膜上的效果與電轉(zhuǎn)的強(qiáng)度、重復(fù)、持續(xù)時(shí)間和電脈沖次數(shù)有關(guān)。人工的雙分子層、細(xì)胞或組織依其自身具體的屬性已經(jīng)能夠被若干常用的電轉(zhuǎn)操作程序所通透。在基于電穿孔的轉(zhuǎn)基因操作中，外源DNA通過可逆的電穿孔被引入胞內(nèi)，外源基因在其新的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并隨著細(xì)胞分裂而被遺傳。用電轉(zhuǎn)的方法結(jié)合能夠誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因的非病毒基因修飾系統(tǒng)，如轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，是病毒載體系統(tǒng)外的另一種修飾免疫效應(yīng)細(xì)胞的有效方法。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，如Sleeping Beuty或PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，包含有轉(zhuǎn)座酶編碼序列，其編碼的轉(zhuǎn)座酶識別兩側(cè)的重復(fù)序列并能高效介導(dǎo)整合至宿主細(xì)胞基因組。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)結(jié)合電轉(zhuǎn)已經(jīng)具有廣泛治療應(yīng)用的前景，并完成了達(dá)到臨床級別的要求(Kebriaei P,Huls H,Jena B,Munsell M,Jackson R,et al.(2012)Infusing CD19-Directed T Cellsto Augment Disease Control in Patients Undergoing Autologous HematopoieticStem-Cell Transplantation for Advanced B-Lymphoid Malignancies.Human GeneTherapy 23:444–450)，其在T細(xì)胞中具有較高的效率。使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的ACT依賴于對T細(xì)胞與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL)的電轉(zhuǎn)，對此，目前市場上已經(jīng)有較為成熟的商業(yè)化電轉(zhuǎn)儀器及配套緩沖液(例如Lonza Nucleofactor)，近期也有使用SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)通過商業(yè)化的電轉(zhuǎn)體系成功地構(gòu)建CAR-T細(xì)胞的方法的報(bào)道(Jin Z,MaitiS,Huls H,Singh H,Olivares S,et al.(2011)The hyperactive Sleeping Beautytransposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express achimeric antigen receptor.Gene Therapy 18:849–856；Peng PD,Cohen CJ,Yang S,HsuC,Jones S,et al.(2009)Efficient nonviral Sleeping Beauty transposon-based TCRgene transfer to peripheral blood lymphocytes confers antigen-specificantitumor reactivity.Gene Therapy16:1042–1049),并且該利用SB轉(zhuǎn)座子體系的ACT方法已經(jīng)被用于臨床試驗(yàn)(Kebriaei P,Huls H,Jena B,Munsell M,Jackson R,et al.(2012)Infusing CD19-Directed T Cells to Augment Disease Control in PatientsUndergoing Autologous Hematopoietic Stem-Cell Transplantation for Advanced B-Lymphoid Malignancies.Human Gene Therapy 23:444–450)。