[發明專利]一種檢測乙肝外泌體miRNA的電化學傳感器及其制備與應用

有效

• 申請號: 202110477695.2
• 申請日: 2021-04-29
• 公開（公告）號: CN113219032B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 丁世家;劉萍;舒曉佳
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48;C12Q1/6825
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 張博

本發明公開了一種檢測乙肝外泌體miRNA的電化學傳感器及其制備與應用。所述傳感器包括工作電極：表面固定有捕獲探針巰基標記的DNA納米支架；靶物質T鏈誘導的級聯鏈置換反應(L?TEDCR)體系：級聯T型結構復合物Ts、級聯反應輔助鏈Fs，Ts由DNA單鏈P鏈、R鏈、L鏈和L₀鏈組成，所述Fs由DNA單鏈F鏈、L₀鏈組成；以及MOF/DNA級聯酶放大檢測體系。外泌體miRNA加入后，L?TEDCR被快速觸發，產生大量DNA納米支架；產生的DNA納米支架固定在電極上，與MOF/DNA級聯酶結合，從而產生用于檢測外泌體miRNA的顯著放大的電化學信號。本發明的傳感器具有靈敏度高、檢測速度快、特異性好等優點。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種檢測乙肝外泌體miRNA的電化學傳感器及其制備與應用。

背景技術

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染嚴重威脅人類健康，HBV感染標志物眾多，包括臨床上較常使用的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙型肝炎病毒定量(HBV DNA)以及近年來新型血清學標記物，包括乙型肝炎核心相關抗原(hepatitis B core associatedantigen，HBcrAg)、HBV前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)等。現有外周血病毒學標記物檢測手段雖然對于診斷、療效監測等方面各有優勢，但仍不能很好地代替肝組織共價閉合環狀DNA(covalently closedcircular DNA，cccDNA)檢測，因而需要更多的研究去探索更好的血清學指標。

外泌體1983年首次于綿羊網織紅細胞中被發現，大小約為30-150nm，其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中，一些特定的外泌體被檢測為不同肝病的血清標志物。研究發現HBV可編碼HBV相關microRNA，將其命名為HBV miR21，HBV miR21在肝癌細胞系中高表達，其在肝炎活動的患者中與HBV DNA呈正相關。目前，檢測外泌體miRNA的常用方法是定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)。然而，這種方法費時費力，因此促使研究人員開發快速和高靈敏度的新方法來準確測量外泌體miRNA。

最近，熵驅動循環反應(EDCR)，催化發夾組裝(CHA)和雜交鏈反應(HCR)等無酶信號放大方法被探索用于miRNA的放大檢測。為了明顯提高反應速度，參與信號放大傳感系統的可擴散反應物被組裝在一個緊湊的空間中。例如，Ju等人設計了一種定位的HCR，即發夾探針交替結合到滾環擴增(RCA)產生的長DNA鏈上進行mRNA的檢測，與傳統的HCR相比，表現出極快的反應速度。類似地，Wei等人開發了一種用于miRNA成像的定位CHA，其中CHA反應物通過多條單鏈雜交被固定在組裝的DNA納米線上。雖然傳感系統中的局域化的反應底物可以大幅度提高反應速度，但這些策略存在以下缺陷：i)局域底物的構建需要多個組裝步驟，導致費時費力；ii)可擴散反應物與DNA納米線的雜交效率在物理條件下可能較低，直接導致定位結構不完全；iii)CHA和HCR的固有特性，例如不可接受的循環泄漏和嚴格的反應條件，即二價金屬離子(如Mg²⁺)總是對分析性能有不利影響，限制了它們在早期腫瘤診斷中的進一步應用。此外，泄漏可能更嚴重，因為緊湊空間中增加的DNA發夾數量更容易發生非特異性相互作用。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種檢測乙肝外泌體miRNA的電化學傳感器及其制備與應用，基于局域化的級聯鏈置換反應和MOF/DNA級聯酶作為電化學標簽，建立一種新型的電化學傳感器，實現乙肝外泌體miRNA的高靈敏和快速檢測。