[發(fā)明專利]一種檢測乙肝外泌體miRNA的電化學(xué)傳感器及其制備與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110477695.2
• 申請日: 2021-04-29
• 公開（公告）號: CN113219032B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁世家;劉萍;舒曉佳
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48;C12Q1/6825
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 張博

1.一種檢測乙肝外泌體miRNA的電化學(xué)傳感器，其特征在于，包括工作電極、靶物質(zhì)T鏈誘導(dǎo)的級聯(lián)鏈置換反應(yīng)體系、MOF/DNA級聯(lián)酶放大檢測體系，所述工作電極為表面固定有捕獲探針的基底電極，所述捕獲探針為巰基標(biāo)記的DNA納米支架，針對外泌體miRNA擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)；所述級聯(lián)鏈置換反應(yīng)體系包括級聯(lián)T型結(jié)構(gòu)復(fù)合物Ts、級聯(lián)反應(yīng)輔助鏈Fs，所述MOF/DNA級聯(lián)酶放大檢測體系包括MOF/DNA級聯(lián)酶；所述Ts由DNA單鏈P鏈、R鏈、L鏈和L₀鏈組成，所述Fs由DNA單鏈F鏈、L₀鏈組成；所述Ts的末端設(shè)有兩個立足點(diǎn)T1、T2，靶物質(zhì)可與第一個立足點(diǎn)T1結(jié)合，并通過立足點(diǎn)介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)取代P鏈，暴露位于L鏈中的第二個立足點(diǎn)T2；Fs與T2雜交，通過堿基配對的延伸置換出靶物質(zhì)和R鏈，同時產(chǎn)生DNA納米支架，置換出的靶物質(zhì)結(jié)合到相鄰的立足點(diǎn)T1，觸發(fā)下一個循環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生大量的DNA納米支架；DNA納米支架固定在電極表面，與MOF/DNA級聯(lián)酶特異性雜交，捕獲MOF/DNA級聯(lián)酶，形成三層復(fù)合材料，產(chǎn)生電化學(xué)信號，通過檢測電化學(xué)信號實(shí)現(xiàn)外泌體miRNA的檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于：所述P鏈的核苷酸序列為：

5'- TTTTTCCCTTAGCTTATCAGACTGA-3'（SEQ ID NO.1）；

所述R鏈的核苷酸序列為：

5'- CCTACGTCTCCAACTAACTTACGG-3'（SEQ ID NO.2）；

所述L鏈的核苷酸序列為：

5'-GTAGAATGCAGTGTAGTAGAATGCAGTGTAGTAGAATGCAGTGTAGTAGAATGCAGTGTAGTAGAATGCAGTGTA -3'（SEQ ID NO.3）；

所述L₀鏈的核苷酸序列為：

5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGGGCCGTAAGTTAGTTGGAGACGTAGGTTTACACTGCATTCTAC-3'（SEQ ID NO.4）；

所述F鏈的核苷酸序列為：

5'- CCTACGTCTCCAACTAACTTACGGCCCTTAGCTTATCAGACTGA -3'（SEQ ID NO.5）；

所述靶物質(zhì)T鏈（靶序列T）的核苷酸序列為：

5'- TAGCTTATCAGACTGATGTTGA -3'（SEQ ID NO.6）。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于：所述MOF/DNA級聯(lián)酶由類葡萄糖氧化酶活性的AuNPs/MOF、具有過氧化物酶樣活性的氯化血紅素/G-四鏈DNAzyme結(jié)合而成，所述AuNPs/MOF由金納米粒子AuNPs 和金屬有機(jī)框架材料MOF結(jié)合而成，所述氯化血紅素/G-四鏈DNAzyme是由G-四鏈體與氯化血紅素形成的復(fù)合物。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于：所述基底電極為金電極；所述電化學(xué)傳感器還包括參比電極和對電極。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）制備級聯(lián)鏈置換反應(yīng)體系：采用DNA單鏈P鏈、R鏈、L鏈和L0鏈經(jīng)一步退火法制得級聯(lián)T型結(jié)構(gòu)復(fù)合物Ts，采用DNA單鏈F鏈和L0鏈經(jīng)一步退火法制得級聯(lián)反應(yīng)輔助鏈Fs；將Ts、Fs、靶物質(zhì)T鏈與DNA雜交液混合，孵育，得級聯(lián)鏈置換反應(yīng)體系；

（2）制備MOF/DNA級聯(lián)酶：采用金納米粒子AuNPs 和金屬有機(jī)框架材料MOF結(jié)合制得AuNPs/MOF，然后采用AuNPs/MOF與氯化血紅素/G-四鏈DNAzyme 結(jié)合制得MOF/DNA級聯(lián)酶；

（3）將步驟（1）所得的級聯(lián)鏈置換反應(yīng)體系滴加至固定有捕獲探針的工作電極表面，孵育；

（4）然后將步驟（2）所得MOF/DNA級聯(lián)酶與DNA雜交液混合反應(yīng)，再將得到的反應(yīng)液滴加到經(jīng)步驟（3）處理后的工作電極上，孵育，得MOF/DNA級聯(lián)酶放大檢測體系。