[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于背景信號(hào)抑制探針的8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶測(cè)定方法、試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110476983.6
• 申請(qǐng)日: 2021-04-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113186248B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳曈勃;涂博成;肖先金;馮子珊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/34
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/34;C12Q1/44;C12Q1/6818
• 代理公司: 北京金智普華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 藍(lán)曉玉

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于背景信號(hào)抑制探針的8?氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶測(cè)定方法、試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明利用Lambda核酸外切酶對(duì)底物結(jié)構(gòu)的選擇性以及8?氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶對(duì)8?氧代鳥(niǎo)嘌呤的識(shí)別切割作用，結(jié)合背景信號(hào)抑制探針對(duì)λexo副活性的抑制作用，構(gòu)建了一種新的8?氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶熒光測(cè)定方法。具體包括：將λexo緩沖液、含有熒光基團(tuán)及猝滅基團(tuán)的報(bào)告探針序列、含有8?氧代鳥(niǎo)嘌呤的背景信號(hào)抑制探針序列混合；將混合液加熱至85℃，然后逐漸冷卻至37℃，加入待測(cè)樣品；在37℃下孵育；孵育結(jié)束后加入λexo，進(jìn)行酶切反應(yīng)，之后進(jìn)行熒光檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于背景信號(hào)抑制探針的8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶測(cè)定方法、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

8-氧代鳥(niǎo)嘌呤是一種常見(jiàn)的由于活性氧引起的DNA氧化損傷，該損傷易引起基因突變，可使生命體的健康受到嚴(yán)重影響。8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoguanine DNAglycosylase,OGG)是DNA修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵酶。8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶既有N-端糖基化酶活性，也有AP(apurinic/apyrimidinic)-裂解酶活性。N-端糖基化酶活性可以切下雙鏈DNA上受損的嘌呤堿基，產(chǎn)生一個(gè)AP位點(diǎn)。AP-裂解酶活性可以切割A(yù)P位點(diǎn)的3′或5′端，產(chǎn)生一個(gè)具有3′和5′磷酸的堿基缺口。8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶可識(shí)別并切除8-氧代鳥(niǎo)嘌呤，對(duì)機(jī)體DNA氧化損傷的修復(fù)有著重大的意義。近期研究還表明，8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶是多種疾病的重要生物標(biāo)志物，如膀胱癌、膽囊癌、肺癌等。因此，快速準(zhǔn)確地分析8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶活性具有重要意義。

傳統(tǒng)的DNA糖基化酶檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附法、凝膠電泳、放射性標(biāo)記和色譜法等。這些方法由于具有放射性危害、復(fù)雜耗時(shí)等固有缺陷，難以滿(mǎn)足目前的分析需求。而熒光法由于具有簡(jiǎn)單、安全、靈敏度高等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶活性分析。然而，現(xiàn)有的熒光方法有一個(gè)難題，即方法的靈敏度總是與檢測(cè)體系的復(fù)雜性成正比。具有高靈敏度的熒光檢測(cè)方法往往需要使用到多種昂貴材料，導(dǎo)致檢測(cè)成本高昂，操作流程復(fù)雜。如使用量子點(diǎn)的應(yīng)用可使檢測(cè)限(limit of detection,LOD)低至1.8×10^-3U/mL，但量子點(diǎn)的制備過(guò)程復(fù)雜，不易實(shí)際應(yīng)用；而簡(jiǎn)單檢測(cè)體系的靈敏度則往往難以滿(mǎn)足檢測(cè)需求。現(xiàn)有的8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶熒光檢測(cè)方法無(wú)法兼顧低成本與高靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于背景信號(hào)抑制探針的8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶測(cè)定方法、試劑盒及其應(yīng)用，目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的一部分問(wèn)題或至少緩解現(xiàn)有技術(shù)中的一部分問(wèn)題。

本發(fā)明提供的該方法利用Lambda核酸外切酶(λexo)對(duì)底物結(jié)構(gòu)的選擇性以及8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶對(duì)8-氧代鳥(niǎo)嘌呤的識(shí)別切割作用，結(jié)合背景信號(hào)抑制探針對(duì)λexo副活性的抑制作用，構(gòu)建了一種新的8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶熒光測(cè)定方法來(lái)高靈敏度、簡(jiǎn)單、快速、低成本地檢測(cè)8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶的活性。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種基于背景信號(hào)抑制探針的8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶測(cè)定方法，其特征在于，包括：

將λexo緩沖液、含有熒光基團(tuán)及猝滅基團(tuán)的報(bào)告探針序列、含有8-氧代鳥(niǎo)嘌呤的背景信號(hào)抑制探針序列混合；背景信號(hào)抑制探針在8-氧代鳥(niǎo)嘌呤位點(diǎn)處被切割后，與報(bào)告探針在5’-熒光基團(tuán)末端形成2-nt突出結(jié)構(gòu)；

將混合液加熱后逐漸冷卻，之后，加入待測(cè)樣品孵育；

孵育結(jié)束后加入λexo，進(jìn)行酶切反應(yīng)，之后進(jìn)行熒光檢測(cè)。在進(jìn)行未知樣品檢測(cè)前，先利用已知濃度樣品的熒光變化率建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

進(jìn)一步地，所述含有熒光基團(tuán)及猝滅基團(tuán)的報(bào)告探針序列為：熒光基團(tuán)-CCTCCACAGACACATAC-猝滅基團(tuán)。