[發明專利]一種基于RAS變異新生抗原表位的融合蛋白納米疫苗及其制備方法

在審

• 申請號: 202110476341.6
• 申請日: 2021-04-29
• 公開（公告）號: CN113069537A
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 王建新;顧云;張聿恒
• 申請（專利權）人: 江蘇欣生元生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61K39/39;A61K9/51;A61K47/36;C07K19/00;C12N15/70;A61P35/00
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本發明的一種基于RAS變異新生抗原表位的融合蛋白納米疫苗，屬于治療性腫瘤疫苗領域。所述“抗原表位融合蛋白”疫苗包含了至少可以引起人細胞癌變的4種RAS新生抗原，并加入具有刺激抗體生成和T細胞反應的佐劑；該疫苗可以通過通過皮下或肌肉注射施用，所產生的抗變異RAS新生抗原的殺傷性T細胞可以精準識別帶有RAS變異的癌變細胞并將其殺死，從而達到治療腫瘤的目的。

技術領域

本發明屬于免疫治療性疫苗領域，涉及一種特定RAS基因變異所產生的多種腫瘤新生抗原表位組合形成的融合蛋白疫苗。

背景技術

腫瘤新生抗原是一類由于腫瘤細胞基因突變所導致的變異蛋白序列中具有宿主抗原性的多肽片段。這類新生抗原可以被宿主免疫系統識別為“外源性”抗原而激活特異性免疫反應。基于腫瘤“新生抗原”的治療性疫苗通過激活患者體內可能存在的新生抗原的免疫細胞，達到識別和殺傷腫瘤的目的。同時也可以通過主動免疫建立抗腫瘤免疫記憶。

絕大部分腫瘤新生抗原具有強烈的個性特點。從基因變異來看，不同腫瘤會帶有不同蛋白靶點變異，而同一蛋白靶點也可能有不同核酸和氨基酸變異以及不同基因變異模式等。而從患者免疫系統來看，由于個體HLA亞型不同也會導致個體對同一變異免疫反應的差異。這種差異決定針對腫瘤新生抗原的治療性疫苗通常具有非常明顯的個性化。但與此同時，科學界也在積極尋求具有相對“共享性”的新生抗原并研發相對的“預制性”和“通用性”的的治療性腫瘤性疫苗。

RAS是細胞生長信號通道中最為重要的一個蛋白。RAS通過反復磷酸化和去磷酸化控制著細胞生長的速度。一旦RAS蛋白發生變異，失去調節作用，讓細胞生長信號通道處于“永久開放”狀態，細胞癌變就不可避免了。正因為其作用如此重要，RAS蛋白在人類基因組中保持高度一致，為人類基因組中極少不具有“基因多樣性”的蛋白。同時，RAS致癌變異在位點和種類方面也保持高度的局限性和特異性。例如發生在第12位和61位氨基酸的不超過10種變異涵蓋了99％以上的RAS。這些特點都讓源自RAS的腫瘤新生抗原成為理想的免疫治療靶點。

基于RAS腫瘤新生抗原的治療性腫瘤疫苗已經在多個臨床實驗中進行測試。這類疫苗包括多肽疫苗和mRNA疫苗，這兩類技術平臺都有其優點和缺點。多肽疫苗安全性高，但是抗原過于分散不利于免疫系統的識別和激活。而mRNA疫苗則具有遞送和保存，以及在體內轉錄成多肽抗原的效率等其他方面的問題。

發明內容

本發明的目的是：通過構建并表達包含主要RAS變異抗原多肽的融合蛋白，達到集聚抗原，增大體積，定量免疫目的。

本發明的一種基于RAS變異新生抗原表位的融合蛋白納米疫苗，該蛋白包括至少4種不同的RAS突變基因，這些突變涵蓋了常見胰腺癌、結直腸癌以及包括肺癌在內的各種腫瘤中RAS蛋白99％以上的突變。利用不少于4種17個氨基酸的多肽片段進行隨機組合(N≥4)，多肽片段見序列表，多肽之間用蛋白接頭(GGGGS)_n進行無順序差別的隨機連接形成融合蛋白的形式，并與免疫佐劑及納米顆粒組成一種混合微粒。免疫佐劑為Poly-ICLC。納米顆粒是可降解的。

一種基于RAS變異新生抗原表位的融合蛋白納米疫苗方法，其步驟如下：

(1)表達載體的構建：選取7種上述可能的變異多肽氨基酸序列用(GGGGS)3序列作為融合蛋白接頭進行適當排序設計成融合蛋白基因，按照大腸桿菌密碼子偏好優化后進行合成，構建于質粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI酶切位點間形成rRAS-mEpivax融合蛋白載體，經測序鑒定后備用；

(2)轉化：將大腸桿菌感受態加入rRAS-mEpivax融合蛋白載體在培養基上培養菌落；

(3)誘導分泌表達：將活化的含載體rRAS-mEpivax的BL21重組菌株接種到卡那霉素的新鮮TB培養基中進行分泌表達；

(4)純化：對RAS重組多肽裂解液進行純化；