[發(fā)明專利]一種檢測含巰基蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110475786.2
• 申請日: 2021-04-29
• 公開（公告）號: CN113109298B
• 公開（公告）日: 2023-02-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張磊;王露露;趙倩倩;沈晶晶;范曲立;黃維
• 申請（專利權(quán)）人: 南京郵電大學(xué)
• 主分類號: G01N21/552
• 分類號: G01N21/552
• 代理公司: 南京正聯(lián)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32243
• 代理人: 盧霞

本發(fā)明提供一種檢測含巰基蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)的方法，實現(xiàn)了Au@Ag納米顆粒在含巰基蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)檢測中的應(yīng)用，可在單納米顆粒尺度上對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)型變化的高靈敏度檢測，而且蛋白質(zhì)的展開程度與Au@Ag納米立方體?含巰基蛋白質(zhì)組裝體散射光譜的紅移量呈相關(guān)關(guān)系，實現(xiàn)了快速、高靈敏地檢測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中無法實時監(jiān)測蛋白質(zhì)三維折疊狀態(tài)的技術(shù)難題，操作簡單。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物傳感領(lǐng)域，具體涉及一種基于Au@Ag納米立方顆粒構(gòu)建蛋白質(zhì)等離子體組裝體檢測含巰基蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)的方法。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)分子的生物活性是由其特定的氨基酸序列及其特定氨基酸空間三維結(jié)構(gòu)決定的，如果三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，整個蛋白質(zhì)分子都會發(fā)生變化，甚至可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)失去活性，蛋白質(zhì)的生物活性功能是與其三維結(jié)構(gòu)具有密切關(guān)聯(lián)的，所以通過檢測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化研究其生物活性是非常重要的一個研究手段。

等離子激元是納米光子學(xué)新興的一個子領(lǐng)域，因為其在納米尺度控制和操縱光的潛在應(yīng)用而吸引了越來越多的關(guān)注；表面等離子共振是貴金屬粒子表面和限制在納米粒子表面上的入射光電子之間的相互作用，由于等離子共振的發(fā)生使得金屬納米顆粒具有優(yōu)異的光學(xué)和物理性質(zhì)，包括強吸收和散射光譜，光穩(wěn)定性等。隨著暗場顯微鏡的出現(xiàn)促進(jìn)了對納米顆粒等離子激元，特別是貴金屬尺寸、形狀、組成以及局部環(huán)境的影響的研究，這進(jìn)一步促進(jìn)其在生物標(biāo)記和檢測中的使用，同時基于納米顆粒等離子共振性質(zhì)使它們能夠用作靈敏的傳感器、功能性納米探針、生物檢測以及藥物篩選。根據(jù)金屬納米顆粒的SPR散射峰信號的變化，來判斷顆粒所處環(huán)境的變化。且貴金屬納米復(fù)合材料相對于單一的金屬納米顆粒，能夠較好的控制較大尺寸的金屬納米顆粒的形貌與均一性，在應(yīng)用方面也比單一的金屬納米顆粒應(yīng)用廣泛；最為重要的一點，復(fù)合結(jié)構(gòu)的貴金屬納米顆粒有著較高的靈敏性，特別是生物檢測和化學(xué)檢測上有較大的優(yōu)勢。

體外蛋白質(zhì)去折疊和重折疊實驗可以通過使用尿素，鹽酸胍(胍鹽)，加熱或者加酸堿等方法達(dá)到，尿素和鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性是可逆過程，而高溫等方法則是不可逆的過程。通過變性劑使蛋白質(zhì)變性，再去除變性劑重新折疊蛋白質(zhì)，使用光譜監(jiān)測蛋白質(zhì)變性過程是現(xiàn)有技術(shù)手段，但僅采用現(xiàn)有的光譜技術(shù)手段檢測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)，存在檢測精確度不高、檢測不靈敏的等問題且不能實現(xiàn)實時監(jiān)測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種檢測含巰基蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)的方法，實現(xiàn)了Au@Ag納米顆粒在含巰基蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)檢測中的應(yīng)用，提供了一種可以快速、高靈敏地檢測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中無法實時監(jiān)測蛋白質(zhì)三維折疊狀態(tài)的技術(shù)難題，操作簡單。

第一方面，本發(fā)明提供一種檢測含巰基蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)狀態(tài)的方法，所述方法包括以下步驟：

步驟一：稱取一定量的待測樣品，所述待測樣品為未知折疊狀態(tài)的含巰基蛋白質(zhì)，將待測樣品溶解于磷酸緩沖溶液，靜置一段時間進(jìn)行孵化，配置成待測蛋白質(zhì)溶液；

步驟二：采用Au@Ag納米顆粒吸附固定在透明基底片上形成LSPR生物傳感器；將步驟一獲得的待測蛋白質(zhì)溶液稀釋，然后滴加到所述LSPR生物傳感器上，孵育一段時間后沖洗、吹干形成Au@Ag納米顆粒-蛋白組裝體；

步驟三：暗場顯微鏡下觀察所述組裝體的等離子散射光譜的紅移量，根據(jù)散射光譜紅移量與特定蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)之間的對應(yīng)關(guān)系模型，可以直接判斷待測特定蛋白質(zhì)目前的折疊狀態(tài)。

第二方面，本發(fā)明提供一種散射光譜紅移量與特定蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)之間的對應(yīng)關(guān)系模型的建立方法，所述方法包括以下步驟：

選取自然狀態(tài)下高活性的蛋白質(zhì)配置成溶液后，與Au@Ag納米顆粒進(jìn)行組裝形成組裝體；