[發明專利]基于LAMP技術的河鲀及其制品快速鑒定方法

在審

• 申請號: 202110475190.2
• 申請日: 2021-04-29
• 公開（公告）號: CN113801942A
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發明（設計）人: 丁艷菲;朱誠;陳成統;呂晨澤;張雷蕾;黃麗紅
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 杭州恒翌專利代理事務所(特殊普通合伙) 33298
• 代理人: 王從友

本發明涉及一種生物檢測領域，尤其涉及基于LAMP技術的河鲀及其制品快速鑒定方法及該方法使用的引物對和試劑盒。本發明基于COI序列和D?loop序列分別設計兩組特異性LAMP引物組(引物LAMPCOI及LAMPCR)。實驗結果顯示：引物LAMPCOI可對6種東方鲀屬河鲀物種進行擴增，與非東方鲀屬的2種河鲀、7種非河鲀樣品均不發生反應；引物LAMPCR只與暗紋東方鲀物種發生特異性反應，與其他河鲀及非河鲀樣品不發生反應。兩組引物的靈敏度均為0.1%，而檢測限達到10 pg。將兩組引物用于市售商品的物種鑒定：在30種河鲀制品中，均檢測到東方鲀屬物種成分，12?14號、21?30號樣品則被鑒定為暗紋東方鲀；而在20種無標簽魚肉制品中，只有17?20號樣品檢測到含有東方鲀屬物種成分。

技術領域

本發明涉及一種生物檢測領域，尤其涉及基于LAMP技術的河鲀及其制品快速鑒定方法寄 該方法使用的引物對和試劑盒。

背景技術

河鲀魚(Pufferfish)作為我國等亞洲沿海地區的傳統美食，具有非常高的營養價值和經 濟價值。但野生河鲀含有劇毒，食用不當可造成嚴重的中毒甚至死亡。市場上存在河鲀魚冒 充其他水產品出售的現象，嚴重損害消費者的生命健康。僅憑形態學方法很難對河鲀制品進 行鑒別，因此急需建立河鲀物種及其制品的快速、準確的分子鑒定方法。

食品鑒定主要有傳統形態學方法、理化分析以及分子生物學方法。經過深加工的食品， 完全不具備活體狀態下的形態后，形態學鑒定的方法完全不能使用。食品的理化分析是指借 助測量工具或儀器，針對蛋白質和脂肪等性質進行分析，常見方法有酶聯免疫吸附分析 (ELISA)、免疫熒光技術(IFT)和高效液相色等方法。但是這些方法往往需要較為新鮮的樣品， 一旦食品變質，就會對鑒定結果產生影響。此外，近些年新興的無損檢測技術也受到越來越 多的關注。該技術可以利用光學、電磁學和聲學的技術，對食品的表面或內部的結構和性質 進行檢測。例如：X射線法、太赫茲技術和紅外光譜法。這些方法雖然快速、無損、信息量 大，但是其儀器的維護成本和模型的建立與改進需要的后期成本和技術門檻太高。

為此，申請人申請的中國發明專利申請(CN108950007A，公開號：20181207)以4種我 國東部沿海地區常見的河鲀為研究對象，即河鲀有黃鰭東方鲀(Takifuguxanthopterus)、 暗紋東方鲀(Takifugu fasciatus)、菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)和紅鰭東方鲀 (Takifugu rubripes)，篩選構建適合的DNA條形碼COI序列，并在此基礎上，設計2對HRM 引物，提供一種基于COI序列的河鲀及其他魚肉制品的HRM快速鑒定方法。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)由Notomi等 于2000年提出，是一種新型的核酸等溫擴增技術，即在恒溫條件下利用一種具有鏈置換功能 的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)進行核酸的快速擴增。其引物設計主要針對目的片段 5’端和3’端的6個區域設計2對特異性引物，包括1對內引物(FIP、BIP)、1對外引物 (F3、B3)。在60～65℃的恒定溫度下，內引物識別相應的位點并延伸，同時外引物在Bst DNA polymerase的作用下將內引物形成的鏈置換出來，形成一個啞鈴狀結構的DNA片段，為后續 反應提供模板。之后內引物對其進行識別、延伸，最終形成一系列莖環結構和多環花椰菜結 構的DNA片段混合物。