[發(fā)明專利]恒溫條件下合成核酸的方法及試劑盒和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110473121.8
• 申請(qǐng)日: 2021-04-29
• 公開（公告）號(hào): CN113201583B
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛瑞;王天祚;蔡挺
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國(guó)科寧波生命與健康產(chǎn)業(yè)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844;C12P19/34;C12N15/11
• 代理公司: 上海碩力知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31251
• 代理人: 郭桂峰

本發(fā)明公開了恒溫條件下合成核酸的方法及試劑盒和應(yīng)用。所述方法為：提供一種核酸的步驟，該核酸3’至5’方向依次由M1c、F1c、M、R1、M2c區(qū)組成，其中M區(qū)包括M1和M2區(qū)，所述核酸的5’端的M2c區(qū)和3’端的M1c區(qū)與同一鏈上的M區(qū)的退火能形成閉合環(huán)結(jié)構(gòu)；使用引物第一寡核苷酸I、第二寡核苷酸II分別與所述核酸的F1c區(qū)、R1c區(qū)退火，以核酸自身為模板進(jìn)行反應(yīng)使所述核酸鏈不斷延伸。利用本發(fā)明的核酸合成方法，所用核心引物的長(zhǎng)度約為30bp，較LAMP和CAMP所用的約為40bp的核心引物縮短了10bp，可節(jié)省約四分之一的引物成本，同時(shí)還提高了核酸合成的反應(yīng)速率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種恒溫條件下合成核酸的方法及試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)

基于20世紀(jì)50年代沃森和克里克提出的堿基互補(bǔ)配對(duì)，核苷酸序列互補(bǔ)性的分析方法可直接分析基因所攜帶的遺傳特征。該分析是一種鑒定遺傳疾病、癌變、微生物等非常有力的方法。而當(dāng)樣品中靶基因含量非常少時(shí)一般不易檢測(cè)，必須對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增或使其檢測(cè)信號(hào)放大。作為擴(kuò)增靶基因的方法，PCR方法被認(rèn)為是最經(jīng)典方法(Saiki，Gelfandet al.1988)，亦是體外核酸序列擴(kuò)增應(yīng)用最為普遍的技術(shù)。PCR方法的主要問(wèn)題是：實(shí)際操作中必須要用專門的程序溫度控制系統(tǒng)；樣品和反應(yīng)溶液易受到外部污染，假陽(yáng)性問(wèn)題較為突出。例如：一旦PCR中偶然誤合成互補(bǔ)鏈，在接下去的反應(yīng)中該產(chǎn)物以模板運(yùn)行，就會(huì)造成錯(cuò)誤的結(jié)果。

另一方面，相較于繁瑣的程序溫控過(guò)程合成核酸，科學(xué)家亦開發(fā)出在恒溫條件下合成核酸的技術(shù)(Zhao，Chen et al.2015)，主要包括以下幾種：依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、依賴解旋酶的擴(kuò)增(HDA)、重組聚合酶擴(kuò)增(RPA)和競(jìng)爭(zhēng)性互補(bǔ)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(CAMP)等。

NASBA，也稱TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增方法)不需要復(fù)雜的溫度控制。NASBA需要熱變性步驟直到雙鏈DNA形成，但是接下去的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在等溫條件下通過(guò)T7 RNA聚合酶得以進(jìn)行。必須要用多種酶組合例如反轉(zhuǎn)錄酶，RNase H，逆轉(zhuǎn)錄酶酶和T7 RNA聚合酶，多種酶的組合費(fèi)用相對(duì)較高。同時(shí)由于復(fù)雜的多種酶反應(yīng)條件，使得該方法成本較高，同時(shí)操作較為繁瑣使得推廣存在一些障礙。

RCA(滾環(huán)擴(kuò)增，Rolling Circle Amplification)旨在模仿微生物中環(huán)狀DNA的滾環(huán)復(fù)制過(guò)程，對(duì)于環(huán)狀單鏈DNA模板，與該模板相結(jié)合的引物在原方法僅能實(shí)現(xiàn)對(duì)于環(huán)狀核酸的擴(kuò)增。該方法亦存在需多種酶的問(wèn)題，擴(kuò)增時(shí)間較長(zhǎng)。

鏈替代擴(kuò)增(Strand Displacement Amplification，SDA)方法也是人們所知的擴(kuò)增具有序列與靶序列互補(bǔ)的模板DNA的方法(Zhang，Cui et al.1992)。SDA擴(kuò)增產(chǎn)物與天然核酸結(jié)構(gòu)不同，并且對(duì)用限制酶來(lái)斷裂或?qū)U(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用到基因克隆上存在限制。這方面也是導(dǎo)致費(fèi)用較高的主要原因。此外，應(yīng)用該方法是存在限制酶崩解而導(dǎo)致的非特異信號(hào)問(wèn)題。

依賴解旋酶DNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Helicase-dependent Isothermal DNAAmplification，HDA)是由美國(guó)NEB公司研究人員于2004年發(fā)明的一種新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Vincent，Xu et al.2004)。該技術(shù)模擬自然界生物體內(nèi)DNA復(fù)制的自然過(guò)程，在恒溫條件下利用解旋酶解開DNA雙鏈，同時(shí)DNA單鏈結(jié)合蛋白(single-strandedDNA-bindingprotein，SSB)用以穩(wěn)定解開的單鏈，并為引物提供結(jié)合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互補(bǔ)鏈。新合成的雙鏈在解旋酶的作用下又解成單鏈，并作為下一輪合成的模板進(jìn)入上述的循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)式增長(zhǎng)。