[發(fā)明專利]恒溫條件下合成核酸的方法及試劑盒和應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110473121.8 | 申請日： | 2021-04-29 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN113201583B | 公開（公告）日： | 2022-02-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 毛瑞;王天祚;蔡挺 | 申請（專利權(quán)）人： | 國科寧波生命與健康產(chǎn)業(yè)研究院 |
| 主分類號(hào)： | C12Q1/6844 | 分類號(hào)： | C12Q1/6844;C12P19/34;C12N15/11 |
| 代理公司： | 上海碩力知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31251 | 代理人： | 郭桂峰 |
| 地址： | 315016 *** | 國省代碼： | 浙江;33 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 恒溫 條件下 合成 核酸 方法 試劑盒 應(yīng)用 | ||
1.非診斷目的的恒溫條件下合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：
1）提供一種核酸的步驟，該核酸3’至5’方向依次由M1c、F1c、M、R1、M2c區(qū)組成，其中M區(qū)包括M1和M2區(qū)，該核酸5’端的M2c區(qū)和3'端的M1c區(qū)分別與M2區(qū)和M1區(qū)互補(bǔ)；所述核酸5’端的M2c區(qū)和3’端的M1c區(qū)與同一鏈上的M區(qū)的退火能形成閉合環(huán)結(jié)構(gòu)；
2）使第一寡核苷酸I與步驟1）提供的所述核酸的F1c區(qū)退火，然后以所述第一寡核苷酸I的F1區(qū)作為合成起點(diǎn)，進(jìn)行合成步驟；其中所述第一寡核苷酸I包括M1區(qū)與Fl區(qū)，其中F1區(qū)與F1c區(qū)互補(bǔ)；
3）步驟1）提供的所述核酸的3’端的M1c區(qū)與M1區(qū)退火，以該核酸為模板合成其自身的互補(bǔ)鏈，將合成完后的核酸序列稱為核酸A；
4）使第二寡核苷酸II與步驟3）提供的所述核酸A的R1c區(qū)退火，然后以所述第二寡核苷酸II的R1區(qū)作為合成起點(diǎn)，進(jìn)行合成步驟；其中所述第二寡核苷酸II包括R1區(qū)和M2c區(qū)，其中R1區(qū)與R1c區(qū)互補(bǔ)；
5）步驟3）提供的所述核酸A的3’端的M區(qū)與臨近的Mc區(qū)退火，以核酸A為模板合成其自身的互補(bǔ)鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒溫條件下合成核酸的方法，其特征在于：所述獲得的核酸鏈能夠自主配對(duì)無限延伸，該核酸鏈上3’端的M1c區(qū)會(huì)與該鏈上的互補(bǔ)區(qū)段M1區(qū)配對(duì)作為合成起點(diǎn)以自身為模板使所述核酸鏈不斷延伸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒溫條件下合成核酸的方法，其特征在于：所述合成核酸的方法中通過引入加速F2/R2引物對(duì)和/或LF/LR引物對(duì)的方法使得核酸擴(kuò)增加速進(jìn)行；其中F2/R2是位于原始核酸互補(bǔ)鏈的F1區(qū)及R1區(qū)的5’側(cè)的區(qū)段，LF/LR是位于F1區(qū)到M1c區(qū)及M2區(qū)到R1的中間區(qū)段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒溫條件下合成核酸的方法，其特征在于：步驟1）中所述的一種核酸的合成方法，包括以下步驟：
1-a）退火步驟，使第一寡核苷酸I與模板的F1c區(qū)退火，其中所述模板3’至5’方向依次由F1c區(qū)、M區(qū)和R1區(qū)組成，其中M區(qū)包括M1和M2區(qū)，所述第一寡核苷酸I包括M1區(qū)與Fl區(qū)，所述M1區(qū)與F1區(qū)的5’側(cè)相連，其中，
F1區(qū)：具有與F1c區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列的區(qū)，
M1區(qū)：與M區(qū)中M1相同的核苷酸序列的區(qū)；
1-b）以所述第一寡核苷酸I的F1區(qū)作為合成起點(diǎn)，合成第一核酸；所述第一核酸具有與所述模板互補(bǔ)的核苷酸序列，所述第一核酸的5’末端具有可與同一條鏈上的M1c區(qū)退火的M1區(qū)，并且通過所述M1c區(qū)與M1區(qū)的退火可形成莖環(huán)；
1-c）在恒溫條件下，使第二寡核苷酸II與所述第一核酸的R1c區(qū)退火，其中所述第二寡核苷酸II包括R1區(qū)和M2c區(qū)，并且M2c區(qū)與R1區(qū)的5’側(cè)相連；其中，
R1區(qū)：具有與R1c區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列的區(qū)，
M2c區(qū)：與M區(qū)中的M2區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列的區(qū)；
1-d）以所述第二寡核苷酸II的R1區(qū)作為合成的起點(diǎn)，合成第二核酸，得到目標(biāo)核酸片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的恒溫條件下合成核酸的方法，其特征在于：步驟1-a）所述模板為RNA，步驟1-b）中的第一核酸通過具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的酶來合成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的恒溫條件下合成核酸的方法，其特征在于：所述F1區(qū)、M區(qū)和R1區(qū)的核酸片段均為20bp。
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