[發明專利]鑒別玉山魚榧、細香榧、大香榧和磐大榧的引物及方法

在審

• 申請號: 202110467766.0
• 申請日: 2021-04-28
• 公開（公告）號: CN113493852A
• 公開（公告）日: 2021-10-12
• 發明（設計）人: 李海波;陳紅星;張蘇炯;沈建軍;宋其巖;陳友吾;葉碧歡;胡傳久
• 申請（專利權）人: 浙江省林業科學研究院;磐安縣自然資源和規劃局;磐安縣中藥產業發展促進中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明涉及一種快速鑒別香榧新品種玉山魚榧、細香榧、大香榧和磐大榧的分子特征性熒光SSR標記引物及方法。所述分子特征性熒光SSR標記引物核苷酸序列如下：上游引物Tg_U971F：5′?FAM?TGTCCTCCTGCTCTGGGTAG?3′；下游引物Tg_U971R：5′?GGCCTTACCAAACGAAATCA?3′。本發明的有益效果主要體現在：本發明分子特征性熒光SSR標記引物可利用針葉DNA即同時對香榧新品種玉山魚榧、細香榧、大香榧和磐大榧進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是傳統方法即根據果實形態學特征的辨別香榧品種所不能替代的分子手段。

(一)技術領域

本發明涉及一種快速鑒別香榧品種鑒別香榧品種玉山魚榧、細香榧、大香榧和磐大榧的分子特征性熒光SSR標記引物及方法。

(二)背景技術

香榧隸屬紅豆杉科(Taxaceae)榧樹屬(Torreya)植物，是榧樹種 (Torreyagrandis)中的優良變異經人工選育后嫁接繁殖栽培的優良品種，也是目前榧樹中唯一進行人工規模栽培的變種。香榧是我國特有的珍貴經濟樹種，具有食用、藥用、材用、綠化等多種用途。

香榧至今已有1300多年的栽培歷史，主要分布于長江流域以南的浙江、江蘇、安徽、福建、江西、湖南、湖北、四川、云南和貴州等10省。香榧的實生嫁接繁殖產生了豐富的變異類型，歷經多年的優株選育和大批量繁殖試驗，浙江省林業育種工作者選育出了多個香榧品種。2011年，良種‘細榧’(T.grandis‘Xifei’)通過國家林業局林木品種審定委員會審定。近年來，浙江省審(認)定了‘珍珠榧’、‘大長榧’、‘象牙榧’、‘東白珠’、‘脆仁榧’、‘朱巖榧’、‘丁山榧’、‘東榧1 號’、‘東榧2號’、‘東榧3號’、‘大葉種細榧’、‘磐安長榧’、‘玉山魚榧’、‘磐大榧’等新品種。隨著榧樹新品種的不斷選育和香榧產業的發展壯大，這些新品種的鑒定與知識產權保護也急需相應的分子技術手段跟進。

香榧品種的鑒別一直是基于傳統的形態學上的分類，即根據盛果期香榧果實或種子的性狀分為圓籽型(大、中、小圓榧等)和長籽型(細榧、芝麻榧、米榧、茄榧、撩牙榧、旋紋榧等)。這一鑒別方法需要在一年中的果實成熟后才能鑒定選種，無法進行早期鑒別。自2000年以來，一些基于PCR的分子標記技術如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repea，簡單序列重復區間擴增多態性)和SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism，相關序列擴增多態性)相繼用于了香榧品種分類、遺傳變異和居群遺傳多樣分析。

然而這些分子標記所采用的均為通用型引物，其PCR擴增圖譜不僅復雜、重復性差，而且特異性不高，需經過大量的篩選工作，因此并不適合于品種鑒別。SSR(SimpleSequence Repeat，簡單重復序列；或 Microsatellite，微衛星)為共顯性標記，能區分純合子和雜合子，能檢測復等位基因，且具有多態性豐富、操作簡單、結果可靠、重復性好等優點。近年來，有基于榧樹轉錄組測序開發SSR標記的報道，但這些SSR標記的可用性是基于傳統的聚丙烯酰胺凝膠電泳，對條帶的人工判讀誤差較大，難以準確區別出SSR位點上等位基因在幾個堿基上的差異；而且這些SSR標記也尚未進行多態性篩選工作，因此是否可用于香榧品種的準確快速鑒別不得而知。

熒光SSR標記的開發是基于DNA測序平臺的毛細管電泳檢測方法，是以不同顏色的熒光基團(如FAM、HEX、TAMRA等)來標記一對SSR 引物中的一個引物末端，利用熒光檢測器對產物檢測，達到自動識別擴增產物的大小，克服了傳統銀染法聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的不足，具有快速、高效、精確、靈敏等技術優勢。因此，利用熒光SSR標記技術開發香榧新品種或優良、特色品種的特征SSR指紋(基因型)，揭示品種間的基因型差異，對于品種的鑒別與知識產權保護具有重要意義。但迄今為止，國內外尚無利用熒光SSR標記技術開發特征SSR指紋鑒別香榧品種的報道。

(三)發明內容