[發明專利]鑒別玉山魚榧、細香榧、大香榧和磐大榧的引物及方法

在審

• 申請號: 202110467766.0
• 申請日: 2021-04-28
• 公開（公告）號: CN113493852A
• 公開（公告）日: 2021-10-12
• 發明（設計）人: 李海波;陳紅星;張蘇炯;沈建軍;宋其巖;陳友吾;葉碧歡;胡傳久
• 申請（專利權）人: 浙江省林業科學研究院;磐安縣自然資源和規劃局;磐安縣中藥產業發展促進中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

1.用于鑒別香榧新品種玉山魚榧、細香榧、大香榧和磐大榧的分子特征性熒光SSR標記引物，其核苷酸序列如下：

上游引物Tg_U971F：5′-FAM-TGTCCTCCTGCTCTGGGTAG-3′；

下游引物Tg_U971R：5′-GGCCTTACCAAACGAAATCA-3′。

2.一種快速鑒別香榧新品種玉山魚榧、大香榧和磐大榧的方法，所述方法包括：提取待測香榧品種針葉的基因組DNA作為模板，以分子特征性熒光SSR引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行毛細管電泳檢測，若毛細管電泳峰圖上顯示的基因型為195/195、201/216、192/216或192/213，則待測香榧品種分別為玉山魚榧、大香榧或磐大榧，反之則否；

所述分子特征性熒光SSR引物核苷酸序列如下：

上游引物Tg_U971F：5′-FAM-TGTCCTCCTGCTCTGGGTAG-3′；

下游引物Tg_U971R：5′-GGCCTTACCAAACGAAATCA-3′。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增反應條件如下：98℃預變性2min；98℃變性10s，56℃退火10s，72℃延伸10s，共30個循環；最后于72℃補平2min，終止溫度為4℃。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述熒光毛細管電泳檢測方法如下：將PCR擴增產物稀釋后于96℃變性5min，將變性后的稀釋產物在-20℃下迅速冷凍2min后置入ABI3730XL Genetic Analyzer分析儀，與內標GeneScan^TM-500 LIZ Size Standard同步進行毛細管電泳檢測，用Data Collection 3.0軟件收集數據。

5.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)取取待測香榧品種幼嫩針葉，加液氮磨碎，提取香榧的基因組DNA；

(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特征性SSR引物作為擴增引物，進行PCR擴增：

PCR反應體系每20μL組成如下：

PCR反應條件如下：

98℃預變性2min；98℃變性10s，56℃退火10s，72℃延伸10s，共30個循環；最后于72℃補平2min，終止溫度為4℃；

(3)內標配制：取10ml Hi-Di和80μL GeneScan^TM-500LIZ SizeStandard混勻，離心，以每孔10μL分裝于96孔內標板，離心；將PCR擴增產物稀釋，離心；取稀釋產物按0.5μL/孔加入到分配好的96孔內標板中，混勻，離心，置入PCR儀，于96℃變性5min，之后在-20℃下迅速冷凍2min，離心，得到變性后的PCR產物；將變性后的PCR產物與內標同步置入DNA分析儀進行毛細管電泳檢測，用Data Collection 3.0軟件收集數據；

(4)數據分析：用GeneMapper 4.1軟件對Data Collection 3.0軟件收集的原始數據進行分析，軟件系統根據目標峰的位置與同一泳道中的內標GeneScan^TM-500LIZ SizeStandard進行比較，直接讀出目標SSR片段的準確峰值，純合位點的等位變異數據記錄為X/X，雜合位點的等位變異數據記錄為X/Y或X/Y/Z；

(5)結果判斷：若毛細管電泳峰圖上顯示的基因型為195/195，則待測香榧品種為玉山魚榧；若毛細管電泳峰圖上顯示的基因型為201/216，則待測香榧品種為細香榧；若毛細管電泳峰圖上顯示的基因型為192/216，則待測香榧品種為大香榧；若毛細管電泳峰圖上顯示的基因型為192/213，則待測香榧品種為磐大榧，反之則否。