[發(fā)明專利]一種具有校準(zhǔn)功能的microRNA檢測(cè)試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110467757.1
• 申請(qǐng)日: 2021-04-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113151413A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡騰杰;周秋梅;程丹丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州覓因生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851;C12Q1/6886
• 代理公司: 杭州知見(jiàn)專利代理有限公司 33295
• 代理人: 趙越劍

本發(fā)明公開(kāi)了一種具有校準(zhǔn)功能的microRNA檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒的組成至少包括RT反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液、RT酶、PCR酶、參考品、空白對(duì)照及引物板；所述參考品為2?4次凍融處理后microRNA穩(wěn)定表達(dá)的混合人血清。本發(fā)明通過(guò)熒光定量RT?PCR技術(shù)對(duì)多種microRNA進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，通過(guò)對(duì)試劑盒的優(yōu)化，降低了檢測(cè)難度，尤其適合多靶標(biāo)高通量的快速檢測(cè)；通過(guò)參考品的建立，將因原材料變更、操作差異、設(shè)備等因素造成的波動(dòng)進(jìn)行了消除，降低了檢測(cè)壁壘，不會(huì)因操作差異導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的異常，促進(jìn)依托于microRNA檢測(cè)的試劑盒市場(chǎng)化的發(fā)展。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種具有校準(zhǔn)功能的microRNA檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

microRNA是一類長(zhǎng)約19-25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA分子，這些microRNA通常靶向一個(gè)或多個(gè)mRNA，通過(guò)抑制靶基因的翻譯過(guò)程對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。現(xiàn)有研究表明，常見(jiàn)的癌癥存在相關(guān)的microRNA表達(dá)改變，而且microRNA通常定位于與癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域，因此可推測(cè)microRNA可能發(fā)揮著抑癌基因和癌基因的雙重作用(Esquela-Kerscher,A.and Slack,F.J(2006)Nat Rev Cancer 6,259-269；Calin,G.A.and Croce,C.M.(2007)JClin Invest 117,2059-2066；Blenkiron,C.and Miska,E.A.(2007)Hum Mol Genet 16,R106-R113)。成熟的microRNA會(huì)與其他蛋白質(zhì)一起組成miRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，因此它們?cè)隗w外非常穩(wěn)定(Lu,J.et al.,(2005)Nature 435,834-838；Lim,L.P.et al.,(2005)Nature433,769-773)，在作為腫瘤生物標(biāo)志物方面比mRNA具有更大的優(yōu)勢(shì)，已證實(shí)的microRNA在癌癥中的異常表達(dá)更突出了它們作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在應(yīng)用價(jià)值。

microRNA在不同樣本中表達(dá)水平差異很大，而且序列很短且序列同源，給發(fā)展超靈敏度的檢測(cè)方法帶來(lái)了挑戰(zhàn)。目前使用較多的檢測(cè)方法是Northern blot以及在此基礎(chǔ)上衍生出來(lái)的一些方法，這類方法檢測(cè)過(guò)程冗長(zhǎng)，技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員專業(yè)程度要求相對(duì)較高，且特異性水平不太穩(wěn)定，所以限制了其應(yīng)用。而且提取出來(lái)的microRNA沒(méi)有了蛋白質(zhì)的保護(hù)，容易受外界因素的影響，諸如操作人員、設(shè)備、實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)、反應(yīng)體系都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，導(dǎo)致在普通實(shí)驗(yàn)室不易開(kāi)展，同一樣品不同對(duì)象操作檢測(cè)結(jié)果差異較大，嚴(yán)重影響檢測(cè)的精確性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種具有校準(zhǔn)功能的microRNA檢測(cè)試劑盒，通過(guò)熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)多種microRNA進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，通過(guò)對(duì)試劑盒的優(yōu)化，降低了檢測(cè)難度，尤其適合多靶標(biāo)高通量的快速檢測(cè)；通過(guò)參考品的建立，將因原材料變更、操作差異、設(shè)備等因素造成的波動(dòng)進(jìn)行了消除，降低了檢測(cè)壁壘，不會(huì)因操作差異導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的異常，促進(jìn)依托于microRNA檢測(cè)的試劑盒市場(chǎng)化的發(fā)展。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

一種具有校準(zhǔn)功能的microRNA檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒的組成至少包括RT反應(yīng)液、PCR反應(yīng)液、RT酶、PCR酶、參考品、空白對(duì)照及引物板；所述參考品為2-4次凍融處理后microRNA穩(wěn)定表達(dá)的混合人血清。

所述凍融處理的冷凍溫度為-15℃至-80℃。

所述RT反應(yīng)液包含：RT預(yù)混液5×20％-45％，濃度30-150nM的特異性RT引物，濃度1-4mM的dNTP，濃度5-20mM的MgCL₂，其余為無(wú)核酸酶水。

所述PCR反應(yīng)液包含：PCR預(yù)混液10×20％，濃度2-8mM的MgCL₂，其余為無(wú)核酸酶水。

所述RT酶為逆轉(zhuǎn)錄酶；所述PCR酶為DNA聚合酶。

所述空白對(duì)照為無(wú)核酸酶水。