[發(fā)明專利]實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥性的方法

有效

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• 申請日: 2021-04-28
• 公開（公告）號: CN113025736B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃建勝
• 申請（專利權(quán)）人: 麗水市中心醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京知果之信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11541
• 代理人: 卜榮麗

本發(fā)明提供一種實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥性的方法，包括如下步驟：刮取待測肺炎克雷伯菌株溶于水，熱裂解，離心取上清作為PCR檢測的樣本，分別利用五組特異性引物和探針通過實(shí)時(shí)熒光PCR來檢測樣本中是否帶有碳青霉烯酶基因bla_KPC、bla_NDM、bla_IMP、bla_OXA?48以及ompK36突變序列，判斷樣本菌株對亞胺培南的耐藥性；本發(fā)明的有益效果為：靶點(diǎn)新，借助ompK36突變序列檢測判斷攜帶blaKPC的肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥性高低；速度快，現(xiàn)臨床常用的方法在獲得純菌后還需培養(yǎng)1天方能測定菌株的耐藥性，而本發(fā)明只需2h，大幅縮短檢測時(shí)間；結(jié)果精、通量高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥敏檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥性的方法。

背景技術(shù)

碳青霉烯耐藥性腸桿菌科菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE)感染死亡率高且易傳播。并且CRE的檢出率和感染率呈逐年上升趨勢，其中克雷伯菌屬對亞胺培南耐率從2005年的0.4％迅速提高至2017年的20％，嚴(yán)重威脅國民健康。

CRE的碳青霉烯耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)生碳青霉烯酶和膜孔蛋白變異聯(lián)合高表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶等兩個(gè)方面，其中前者是主要原因，膜孔蛋白o(hù)mpK36變異僅起協(xié)同作用，可一定程度上提高CRE耐藥性。目前我國所有CRE菌株中，約90％的菌株表達(dá)碳青霉烯酶，其中又以KPC酶和NDM酶為主，分別占50-58％和32-33.5％，IMP酶僅占3-5.2％，OXA型碳青霉烯酶在克雷伯菌屬中十分罕見。其中，肺炎克雷伯菌占我國CRE菌株構(gòu)成的73.9％，主要攜帶blaKPC、blaNDM、blaIMP；同時(shí)，碳青霉烯敏感(MIC≤1μg/mL)、低耐藥(4μg/mL≤MIC≤16μg/mL)和高耐藥(MIC≥32μg/mL)肺炎克雷伯菌的ompK基因存在顯著差異。

碳青霉烯類抗生素主要包括亞胺培南(IPM)和美羅培南(MEM)等，是臨床治療腸桿菌科菌感染的重要藥物。高劑量長時(shí)間用藥和雙碳青霉烯聯(lián)合用藥療法被推薦用于MIC≤8μg/mL的低耐藥性碳青霉烯耐藥性肺炎克雷伯菌的抗感染治療，且抗生素治療每提早1小時(shí)患者存活率可提高7.6％。

目前臨床實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)菌藥物敏感性檢測方法中，K-B法通過檢測細(xì)菌抑菌環(huán)大小來定性判斷待測菌耐藥性，但不能測定MIC值；E-test試紙條檢測法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，但檢測項(xiàng)目單一且價(jià)格昂貴；儀器自動(dòng)化微生物鑒定系統(tǒng)僅根據(jù)3個(gè)藥物濃度點(diǎn)推算MIC值，準(zhǔn)確性欠佳；肉湯稀釋法是測定MIC值的金標(biāo)準(zhǔn)，然而該方法十分繁瑣、易受污染、重復(fù)性差。以上4種方法均需獲得純菌后培養(yǎng)16-24小時(shí)方能測定菌株的耐藥性，耗時(shí)2-3天，嚴(yán)重影響臨床抗感染治療。因此，建立一種能夠快速檢測CRE菌株碳青霉烯耐藥性的新方法已十分迫切。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)提供一種快速檢測肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥性的方法，并且創(chuàng)造性地通過ompK36突變序列判斷耐藥性高低，從而提高臨床抗感染療效，減少抗生素使用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥性的方法，包括如下步驟：

(1)刮取待測肺炎克雷伯菌株溶于水，熱裂解，離心取上清作為PCR檢測的樣本；

(2)分別利用五組特異性引物和探針通過實(shí)時(shí)熒光PCR來檢測樣本中是否帶有碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA-48以及ompK36突變序列；

(3)判斷樣本菌株對亞胺培南的耐藥性。