[發(fā)明專利]實時熒光PCR快速檢測肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110466522.0
• 申請日: 2021-04-28
• 公開（公告）號: CN113025736B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發(fā)明（設計）人: 黃建勝
• 申請（專利權）人: 麗水市中心醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京知果之信知識產權代理有限公司 11541
• 代理人: 卜榮麗

1.實時熒光PCR快速檢測肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥性的方法，其特征在于，

包括如下步驟：

(1)刮取待測肺炎克雷伯菌株溶于水，熱裂解，離心取上清作為PCR檢測的樣本；

(2)分別利用五組特異性引物和探針通過實時熒光PCR來檢測樣本中是否帶有碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA-48以及ompK36突變序列；

五組特異性引物和探針的序列如下：

blaKPC正向引物：CGATACCACGTTCCGTCTGG

blaKPC反向引物：GCCATACACTCCGCAGGTTC

blaKPC熒光探針：CAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGC

blaNDM正向引物：TATCACCGTTGGGATCGACG

blaNDM反向引物：GGCTCATCACGATCATGCTG

blaNDM熒光探針：CAATCTCGGTGATGCCGACACTGAG

blaIMP正向引物：CTACCGCAGCAGAGTCTTTG

blaIMP反向引物：CTTGATGAAGGCGTTTATGT

blaIMP熒光探針：GAAGTTAACGGGTGGGGCGTTGTTC

blaOXA-48正向引物：TGCGTGTATTAGCCTTATCG

blaOXA-48反向引物：GGTGTTCATCCTTAACCACG

blaOXA-48熒光探針：CAGGGCGTAGTTGTGCTCTGGAATG

ompK36突變正向引物：GGCGATCAGAATCGTTTGGA

ompK36突變反向引物：GGTCGCCGTAACCTTCGATG

ompK36突變熒光探針：CAACTCGTTTCAGCGGCAACGGAGAATC

其中熒光報告基團FAM標記于探針5’端；熒光淬滅基團TAMRA標記于探針3’端；

(3)判斷樣本菌株對亞胺培南的耐藥性；

若四種碳青霉烯酶基因均無陽性擴增，則認為該菌株對亞胺培南敏感，MIC≤1ug/mL；

若僅blaKPC基因擴增陽性，認為菌株對亞胺培南耐藥，4μg/mL≤MIC≤16μg/mL；

若blaKPC和ompK36突變擴增雙陽性，認為菌株對亞胺培南高度耐藥，MIC≥32μg/mL。

2.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，

步驟(1)中，肺炎克雷伯菌菌株的濃度為1×103cfu/ml至1×106cfu/ml。

3.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，

步驟(1)中，熱裂解菌株提取DNA的方法為在100℃的溫度下加熱10min。

4.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，

若blaKPC基因擴增陽性，利用ompK36突變序列判斷耐藥性高低。

5.根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，

ompK36突變與blaKPC基因存在協(xié)同作用，兩者同時存在的菌株耐藥性強于單獨攜帶blaKPC基因的菌株。