[發明專利]一種高產慶大霉素C組分的工程菌及其構建

在審

• 申請號: 202110463433.0
• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN113278638A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 董澤武;常瑩瑩;滿航;張徳重;嚴寶冬;孫明
• 申請（專利權）人: 黑龍江格林赫思生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/74;C12N15/90;C12N1/21;C12P19/48;C12R1/29
• 代理公司: 天津企興智財知識產權代理有限公司 12226
• 代理人: 陳雅潔

本發明提供了一種高產慶大霉素C組分的工程菌及其構建，通過GenP過表達以提升慶大霉素C組分產量的策略及所得高產工程菌，GenP過表達策略可通過位點整合和同源重組兩種構建方式獲得，使慶大霉素C組分(C1、C1a、C2、C2a)產量提高了34.5％，有望有效降低硫酸慶大霉素產品的生產成本。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，尤其是涉及一種高產慶大霉素C組分的工程菌及其構建。

背景技術

慶大霉素是由刺孢小單孢菌(Micromonosporaechinospora)產生的氨基糖苷類抗生素。它由2-脫氧鏈霉胺和兩個糖基(加拉糖胺和絳紅糖胺)組成，因C6’位甲基化程度不同而分為C1、C1a、C2、C2a及C2b五種組分。慶大霉素通過與靶細胞內核糖體30S亞基16S rRNA上的氨酰基位點結合，引起mRNA錯譯，從而干擾蛋白質的合成殺死病原菌。由于其具有廣譜的抗菌活性和速效殺菌性，且價格低廉，被廣泛應用于臨床治療革蘭氏陰性菌感染，特別是對于具有多重耐藥性的病原體感染，其具有良好的治療效果。

在企業實際生產中，隨著慶大霉素工業菌株的多次傳代，菌株容易出現退化，慶大霉素產量有所下降，制約了慶大霉素的生產，因此尋求合適的策略以提升工業菌株慶大霉素C產量成為亟待解決的問題。傳統的自然選育或人工誘變的方式，具有很大的隨機性，缺少快速的篩選方法，使得定向獲得慶大霉素C高產菌株極其困難，而依托理性的代謝工程改造以提高合成途徑中中間體的轉化效率，有望快速實現慶大霉素C的高產。

發明內容

有鑒于此，本發明旨在提出一種高產慶大霉素C組分的工程菌及其構建，以解決傳統的自然選育或人工誘變的方式，具有很大的隨機性，缺少快速的篩選方法，使得定向獲得慶大霉素C高產菌株極其困難的問題，快速實現慶大霉素C的高產。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種高產慶大霉素C組分的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明的第二目的在于提供上述基因在構建高產慶大霉素C組分工程菌中的應用。

本發明的第三目的在于提供一種高產慶大霉素C組分工程菌YC001、 YC003和YC004，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號分別為 CCTCC No.M2021345，No.M2021346，No.M2021347。

本發明的第四目的在于上述高產慶大霉素C組分工程菌的構建方法，其特征在于：采用位點整合或同源重組進行構建。

位點整合型構建是通過attP整合位點將帶有目的基因的質粒整個整合到基因組attB位點處，這樣構建的菌株需要抗生素來維持其穩定性，否則會出現質粒的丟失，同時，質粒的存在可能會一定程度降低目標產物的產量，但是此構建周期較同源重組短，而同源重組構建是利用同源臂的重組僅將目的基因整合到染色體的固定位置，為穩定菌株，無需添加抗生素，對于工業生產來說，傾向于使用同源重組方式得到的穩定菌株。

優選地，位點整合包括以下步驟：

(1)以位點整合型質粒為載體，構建不同啟動子控制GenP表達的質粒，所述質粒包括啟動子、genP基因，啟動子控制genP的表達；

(2)通過大腸桿菌介導的三親本接合轉移方法將所述質粒導入刺孢小單孢菌原始菌株；

(3)位點整合方式的GenP過表達菌株的篩選，首先篩選硫鏈絲菌素抗性菌株，后提取基因組進行PCR驗證，篩選成功導入啟動子-genP片段的菌株。

優選地，同源重組包括以下步驟：

(1)以復制型質粒為載體，構建GenP表達的同源重組質粒，所述質粒包括rpsLp-cf啟動子、genP基因、上下同源臂，rpsLp-cf啟動子控制genP 的表達；