[發明專利]一種頜骨或骨干發育不良小鼠模型的構建方法

有效

• 申請號: 202110459500.1
• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN113249406B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 胡穎;李鴻宇;王小予;董蕊
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京口腔醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027;C12N15/11;C12Q1/6888
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 錢云

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種頜骨或骨干發育不良小鼠模型的構建方法。所述構建方法包括：將小鼠基因組中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突變為酪氨酸。本發明發現針對小鼠Ano5基因第360位設計打靶載體進行突變，得到的頜骨或骨干發育不良小鼠模型病理改變明顯，且呈現和患者臨床表現相似的骨骼病變特征，利用此構建方法得到的小鼠模型可以為揭示頜骨或骨干發育不良疾病的分子機制提供有效安全的實驗工具。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種頜骨或骨干發育不良小鼠模型的構建方法。

背景技術

頜骨或骨干發育不良(Gnathodiaphysia Dysplasia，GDD)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，病變主要累及口腔和長骨。臨床表現為頜面部畸形、下頜骨牙骨質/骨發育不良和頜骨骨髓炎等；管狀骨側彎、骨皮質增厚和骨脆性增加等。患者在青少年時期可多次發生無誘因骨折，血中堿性磷酸酶水平增高，牙齦溢膿和拔牙后不易愈合。該病給患者及其家人造成極大的精神痛苦和沉重的經濟負擔，目前針對GDD僅限于手術和姑息治療，無特異性的藥物干預措施。因此探究GDD發生的分子機制，對于指導其臨床治療具有重要的意義。

ANO5(Anoctamin 5/TMEM16 E)是GDD的致病基因，其編碼蛋白是ANO家族成員之一。ANO5蛋白具有8個跨膜結構域，以同源二聚體的形式構成通道，可能發揮鈣離子激活的Cl^-通道(Calcium-activated chloride channels,CaCCs)或磷脂爬行酶(Phospholipidscramblase，PLSCR)的功能。ANO5在成年小鼠的顱蓋骨、股骨和下頜骨中高度表達，其雜合突變與GDD的發生密切相關。迄今為止，報道顯示至少有10個ANO5基因突變可導致GDD。體外研究發現，Cys356Arg和Cys356Gly突變可以導致ANO5蛋白不穩定，更易于被蛋白酶體降解；Thr513Ile突變可使細胞發生磷酯酰絲氨酸外翻，從而導致骨骼發生病理性礦化。

利用動物模型對GDD的發病機制進行研究也逐漸被重視。幾個針對Ano5的不同外顯子區域的基因敲除小鼠或者兔子動物模型，主要表現為：①骨骼肌病變表型，如成肌細胞膜融合和修復障礙；②精子活動度減低；③部分GDD骨病變特征。Rolvien等首次利用CRISPR/Cas9方法建立Ano5基因T491F突變(人類p.Ser500Phe)小鼠模型，對12和24周齡小鼠進行了影像學和組織學表型鑒定，僅有純合突變小鼠表現輕微肌肉質量增加的改變，卻未表現任何骨骼相關的病理特征。

到目前為止，多數關于ANO5基因突變的研究，均只限于體外實驗，無法在動物體內模擬發病現場，不能真實再現疾病發生的分子事件。建立動物模型是研究ANO5基因突變導致GDD的更佳途徑。只有一篇文獻報道Ano5基因T491F突變小鼠模型，該突變相當于人類p.Ser500Phe突變，首次是由德國學者Rolvien團隊報道，患者是一位中國裔13歲男孩，其臨床表現為股骨骨折頻發，牙齒萌出障礙，頜骨惡性腫瘤樣改變。但是該突變模型并未重復出GDD患者相關的骨骼病理性改變。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本發明提供一種頜骨或骨干發育不良小鼠模型的構建方法。本發明通過突變小鼠基因組中特定位點，得到一種Ano5基因突變小鼠，其呈現與患者臨床表現相似的骨骼病變特征，適用于頜骨或骨干發育不良疾病的分子機制的研究。

第一方面，本發明提供一種頜骨或骨干發育不良小鼠模型構建方法，包括：

將小鼠基因組中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突變為酪氨酸。

進一步地，基于CRISPR/Cas9方法，通過打靶載體將小鼠基因組中Ano5基因第360位氨基酸由半胱氨酸突變為酪氨酸。

進一步地，所述打靶載體包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

進一步地，所述構建方法包括：

構建打靶載體，并轉染ES細胞；