[發明專利]一種鑒定SMV-SC3的LAMP引物組、試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 202110458248.2
• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN112941243A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 岳愛琴;范姝姝;牛景萍;杜維俊;趙晉忠;王敏;李晨;武文娟
• 申請（專利權）人: 山西農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 西安知誠思邁知識產權代理事務所(普通合伙) 61237
• 代理人: 閔媛媛

本發明提供一種鑒定SMV?SC3的LAMP引物組、試劑盒及其使用方法，包括1對內引物、1對外引物和1對環引物。本發明能夠特異檢測出SMV?SC3病毒，具有特異性強、靈敏度高、反應速率快、操作簡單、經濟的優點，用于田間大豆花葉病毒SMV?SC3早發現早防治，也能用于大豆抗SMV?SC3種質的鑒定和基因定位，對大豆栽培和育種具有重要貢獻。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，涉及一種鑒定SMV-SC3的LAMP引物組、試劑盒及其使用方法。

背景技術

大豆花葉病毒(SMV)是大豆中主要存在的一種病害，嚴重影響大豆的產量及外觀品質。大豆花葉病毒SC3株系在感染早期，大豆葉子沒有明顯的癥狀，但會嚴重影響大豆的產量。王大剛等對黃淮海南部地區山東、河南、安徽大豆花葉病毒株系進行調查時發現23.4％大豆材料葉子中感染SC3株系。侯文煥等對189份大豆材料的SMV-SC3抗性分析發現僅有8份材料具有SMV-SC3抗性。因此對于SMV-SC3的研究迫在眉睫。目前對于SMV的檢測方法有生物學法、酶聯免疫反應(ELISA)、聚合酶鏈式擴增反應(PCR)和實時熒光定量PCR(qPCR)等。生物學檢測法為主要方法，通過觀察植株感病的癥狀鑒定材料是否抗大豆花葉病毒某個毒株，不僅耗時長(一個月左右)，而且通過肉眼觀察的判斷結果準確性低，尤其SMV-SC3毒株侵染大豆在初期時癥狀表型不明顯，利用生物學早期檢測存在較大困難。ELASA通常會引起假陽性，且對操作人員的要求較高；PCR和qPCR檢測均需要專門的儀器，檢測費時費力，且無法特異的對某一種花葉病毒進行檢測。環介導等溫擴增(LAMP)技術是由Notomi等開發的一種快速、靈敏、操作簡單的可視化等溫檢測技術，而且LAMP技術用3對引物進行反應，增加了檢測的特異性。近年來，該方法廣泛應用于病毒、轉基因作物，多種病原菌等的檢測。

袁俊杰等通過在反應體系中添加逆轉錄酶RPA(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)，建立了SMV的檢測體系，但是該方法存在一定的缺點，需要除去蛋白才可進行后續試驗。張雯娜等建立了一步法RT-LAMP檢測大豆花葉病毒的方法，但該方法無法確定感染具體的大豆花葉病毒株系。近年來，隨著基因組測序技術迅速發展，大豆花葉病毒株系基因組序列不斷公布，另外研究者們不斷研究出新的基于LAMP的SNP檢測方法，使LAMP檢測的特異性更強，如AS-LAMP、LAMP-OSD、LAMP-ASO和PE-LAMP等。AS-LAMP是在反向內引物的5’端設計特異性位點，實現特異性擴增。但是該方法的引物依賴于單核苷酸多態性在靶基因中的位置，這使得這個方法在引物設計上缺乏靈活性。LAMP-OSD是將LAMP擴增與一步鏈置換反應(One-step strand displacement，OSD)聯用，反應體系中加入可以對LAMP產物進行特異性識別的OSD探針，借助實時熒光定量PCR儀檢測目標序列。模板中加入具有干擾性的其他模板時，LAMP-OSD熒光信號易受影響，而不利于信號的檢測。一方面LAMP-OSD需要依賴昂貴的儀器，另一方面容易受其他模板的影響，SMV-SC3進行檢測時，可能同時存在其他株系，所以不適合用來特異性檢測SMV-SC3。LAMP-ASO是利用不同等位基因特異性寡核苷酸探針(allele-specific oligonucleotide，ASO)做成芯片，通過抗原抗體反應來檢測LAMP反應的產物，多用于人類疾病基因DNA突變體的檢測。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種鑒定SMV-SC3的LAMP引物組、試劑盒及其使用方法，能夠特異檢測出SMV-SC3病毒，具有特異性強、靈敏度高、反應速率快、操作簡單、經濟的優點，用于田間大豆花葉病毒SMV-SC3早發現早防治，也能用于大豆抗SMV-SC3種質的鑒定和基因定位，對大豆栽培和育種具有重要貢獻，解決了現有技術中存在的問題。

本發明所采用的技術方案是，一種鑒定SMV-SC3的LAMP引物組，包括1對內引物、1對外引物和1對環引物，序列如下：

內引物SC3-FIP-2：