[發明專利]一種聚合物微球及其制備與應用

有效

• 申請號: 202110457533.2
• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN113355313B
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 易喻;岑靈照;應國清;梅建鳳;陳建澍;張彥璐;王旭東
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N11/084
• 分類號: C12N11/084;C12N11/10;C07K16/00;C07K1/22;B01J20/26;B01J20/28;B01J20/30;B01D15/38;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種聚合物微球及其制備與在制備抗體純化填料中的應用，所述聚合物微球是以聚乙烯醇和海藻酸鈉為原料，加入水在80?100℃溶解后，降溫至40℃后加入含ZZ融合蛋白的重組大腸桿菌菌液制成水相；再將液體石蠟和表面活性劑混合為油相，水相緩慢滴加到油相中，30?70℃攪拌形成乳液后，再加入飽和硼酸氯化鈣水溶液，制備得到所述的聚合物微球；所述ZZ融合蛋白是將ZZ蛋白通過連接肽與錨定蛋白(LppOmpA)融合而成；本發明方法制備的聚合物微球的直徑為50?250nm，超大孔徑為1μm至2μm，原料廉價，成本低，操作簡單，省略了常規配基的表達、純化、接枝等制備過程，解決了配基昂貴等問題。

(一)技術領域

本發明涉及一種聚合物微球及其制備與應用。

(二)背景技術

抗體類藥物因其具有靶向性強、特異性高和毒副作用小等特點，在臨床被廣泛應用于疾病的診斷、治療及免疫等方面，應用前景廣闊。然而，抗體藥物生產技術門檻較高，涉及到抗體篩選、抗體重組、高表達細胞株構建、大規模懸浮培養及下游純化等核心技術，隨著分子生物學技術的飛速發展，在抗體篩選、重組、人源化等上游技術方面已沒有太多障礙，目前的困難主要集中在中游的大規模生產及下游純化等方面。當前，約80％的下游工藝采用Protein A親和層析進行快速捕獲，由于Protein A對抗體具有良好的特異結合能力，而且操作簡單，因此被廣泛的利用。然而，Protein A因分子量較大，表達困難，而且表達后的Protein A還需要一系列的分離純化，接枝修飾等過程，造成Protein A親和填料的市場化價格比較昂貴，目前國內成規模生產Protein A親和填料的公司很少，加之國內抗體培養表達的規模較小，色譜操作處理能力受限，因此生產成本居高不下，缺少市場競爭力。

因此，研究可替代載體及純化技術具有重要的現實意義，近年來研究替代蛋白A的小分子功能基逐漸增多，其中最典型的疏水電荷誘導層析，利用疏水作用吸附抗體；調節pH值，使雜環帶電實現洗脫，成為比較有潛力的替代蛋白A的純化抗體模式。另外，Protein A親和介質其配基主要來源于金黃色葡萄球菌蛋白A(StaphyIococcal Protein A，SPA)，其作為一種“廣泛二抗”，能與抗體分子的Fc片段具有良好的親和特性，被廣泛的應用于抗體純化領域。SPA是位于革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌表面的細胞壁相關蛋白結構域，蛋白分子量為42kDa，由16種氨基酸(不含半胱氨酸及胱氨酸)組成，無二硫鍵及復雜的三級結構，因此天然結構十分穩定。由于SPA蛋白較大，表達過程中可能需要面臨蛋白質二級結構發生折疊變形等問題。因此人們通過對SPA蛋白的基因結構進行分析，認為其與IgG結合區主要由E、D、A、B和C五個高度同源的IgG結合結構域組成，都能與IgG1，IgG2和IgG4的Fc段獨立結合，且都顯示具有較強的免疫球蛋白親和活性，其中B結合結構域的結合力最強，同時為了提高B結構域對羥基胺介導的融合蛋白位點特異性化學裂解的耐受性，對B結構域進行基因改造(一個氨基酸殘基發生突變)成Z結構域，可應用于固定化親和配體捕捉IgG中，同時可通過對Z結構域首尾串聯聚合，使其具有更強的捕捉抗體的能力，同時可將其作為一種可自我再生的固定化蛋白基質用于抗體純化親和色譜載體的大批量制備。

本發明利用DNA重組技術將抗體結合域ZZ蛋白通過具有展示大分子蛋白潛能的Lpp-OmpA展示系統展示在大腸桿菌表面，不經過解析、純化，通過多孔載體包埋重組大腸桿菌簡單培養，快速獲得大量廉價的抗體親和色譜填料并用于抗體純化，對部分解決現有填料制備工藝復雜，成本高昂的局限性，降低生產成本具有重要意義。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種用于IgG純化的聚合物微球及其制備方法與應用，以聚乙烯醇和海藻酸鈉為原料，加入重組大腸桿菌后與飽和硼酸氯化鈣溶液進行交聯得到的微球，通過重組大腸桿菌的簡單培養就可以快速獲得大量價廉的抗體親和色譜填料，作為色譜介質應用于抗體分離純化中，操作簡化，價格低廉。

本發明采用的技術方案是：