[發明專利]基于金-石墨烯量子點的電化學生物傳感器在檢測細胞中ctDNA中的應用

有效

• 申請號: 202110456420.0
• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN112986361B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 王青泉;朱蔭華;儲紅霞;張璇;申文君;扈金舟;張秀麗;李寶玉
• 申請（專利權）人: 上海執誠生物科技有限公司
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/26;G01N33/543;G01N33/574
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 范艷靜

本發明提供了一種基于金?石墨烯量子點的電化學生物傳感器在檢測細胞中ctDNA中的應用，該電化學生物傳感器的制備方法包括：稱取原料一水合檸檬酸、組氨酸和色氨酸加入去離子水得到反應液，將反應液放入烘箱內反應，反應結束后得到組氨酸和色氨酸功能化石墨烯量子點，其作為穩定劑和還原劑與氯金酸溶液一步法反應合成金?組氨酸和色氨酸石墨烯雜合物，基于該雜合材料構建了無酶循環擴增電化學DNA傳感器；本發明的電化學生物傳感器通過發夾自組裝，通過金/石墨烯量子點和無酶循環擴增的雙重信號放大策略，使得該電化學傳感器檢測循環DNA具有超高的靈敏度，達到檢測限低至亞皮摩爾水平；同時其檢測重復性好，穩定性優良。

技術領域

本發明屬于電化學生物傳感器技術領域，具體涉及一種基于金-石墨烯量子點的電化學生物傳感器在檢測細胞中ctDNA中的應用。

背景技術

循環腫瘤DNA（ctDNA）是隨細胞凋亡、壞死而釋放到外周血、腦脊液等體液中的，由腫瘤原發灶或循環腫瘤細胞衍生的單鏈或雙鏈DNA片段。多項研究表明，ctDNA作為一種極具臨床應用前景的腫瘤生物標記物，在腫瘤評估等方面備受關注。例如，KRAS基因點突變與包括肺癌、結直腸癌和卵巢癌等在內的多種癌癥密切相關。因此，ctDNA的定量分析在腫瘤的早期診斷、病程進展和預后監測等方面發揮著至關重要的作用。然而，ctDNA定量檢測面臨的最大挑戰是體液中的ctDNA含量極低，需要極高的靈敏度才能實現定量分析與檢測。

目前，ctDNA的分析方法主要有無酶PCR反應、DNA測序、基因芯片和酶輔助的PCR擴增，這些技術相對成熟，卻仍然存在諸多不足。基于無酶PCR的技術，如數字PCR和微滴式數字PCR （ddPCR），已成功應用于ctDNA檢測，卻易被化學物質影響而產生假陰性或假陽性。DNA測序是檢測基因突變的金標準技術，但具有儀器設備昂貴、耗時長等不可避免的缺點。基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應位置的核酸探針產生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據此可重組出靶核酸的序列。但是，該技術成本昂貴、復雜，檢測靈敏度較低，重復性差，分析泛圍較狹窄。為了提高檢測靈敏度，各種酶輔助信號擴增方法包括滾環擴增（RCA）、解旋酶依賴性擴增（HDA）和指數擴增反應已被用來克服標準PCR技術的局限性，在這些策略中使用酶可以顯著提高檢測靈敏度，但是，它可能會導致非特異性和假陽性信號，同時酶又是很昂貴的，并且控制反應條件以確保最佳的酶活性是具有挑戰性的。因此，亟需發展一種經濟實用、簡單快速、靈敏度高的ctDNA分析方法以適應臨床診斷治療需要。

電化學DNA傳感器因其具有高靈敏度、高特異性、低成本和良好便攜性等獨特優點吸引了國內外研究者的廣泛興趣，已經成為包括臨床診斷、微生物檢測和環境監測等許多重要領域的定量分析工具。在經典核酸傳感器中，生物識別過程涉及互補核酸鏈堿基之間的非共價相互作用，表現為捕獲探針和互補靶標序列之間的雜交。固定化核酸可以是莖環探針（SLP），也可以是線形探針（LP）。 對于典型電化學DNA生物傳感器的構建，一般將DNA識別探針固定在電極上，通過特異性雜交捕獲靶標DNA分子，隨后傳感器將相應變化轉換成電化學信號。目前，對于腫瘤細胞中的標志物循環DNA的檢測大部分都是采用基因芯片，PCR擴增的手段進行檢測，而使用電化學DNA傳感器的檢測報道很少。

為了進一步提高電化學DNA生物傳感器的靈敏度，近年來已使用了納米材料，如中孔二氧化硅，金屬納米材料和石墨烯等。石墨烯量子點不僅繼承了石墨烯的優點，而且具有獨特的小粒徑，豐富的邊緣位點和各種官能團，對電解質離子有很強的吸附能力，因而在電化學領域展現出巨大的發展潛質。特殊功能化的石墨烯量子點還具有還原性，利用其作為還原劑與貴金屬納米粒子緊密結合。石墨烯量子點與貴金屬的結合可以實現優勢互補和相互協同。石墨烯量子點表面的疏水基團可以避免貴金屬納米粒子的聚集。不摻雜雜原子的石墨烯量子點的電活性顯著下降，而貴金屬納米材料具有卓越的電導率和優異的電催化能力，兩者結合后的復合材料不僅具有良好的電學性質，且具有良好的空間結構和形貌特征，能有效提高檢測物的分析靈敏度。