[發明專利]基于金-石墨烯量子點的電化學生物傳感器在檢測細胞中ctDNA中的應用

有效

• 申請號: 202110456420.0
• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN112986361B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 王青泉;朱蔭華;儲紅霞;張璇;申文君;扈金舟;張秀麗;李寶玉
• 申請（專利權）人: 上海執誠生物科技有限公司
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/26;G01N33/543;G01N33/574
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 范艷靜

1.一種基于金-石墨烯量子點的電化學生物傳感器在檢測細胞中循環腫瘤DNA中的應用；

該基于金-石墨烯量子點的電化學生物傳感器的制備方法包括如下步驟：

(1)、稱取摩爾比3∶1∶2的檸檬酸、組氨酸和色氨酸混合，加入蒸餾水后超聲10-30min溶解得到反應液，將所述反應液加熱反應，得到組氨酸/色氨酸石墨烯量子點固體產物，并配制成水溶液，然后過濾2h得到組氨酸/色氨酸石墨烯量子點溶液；

(2)、將2-20mL濃度為0.2-1mg/mL的氯金酸溶液在60-100℃下加熱至沸騰，然后加入步驟(1)的所述組氨酸/色氨酸石墨烯量子點溶液中，離心，之后過濾得到組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金雜合物，清洗之后分散在三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中，得到組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金儲備液；

(3)、將三羥甲基氨基甲烷、氯化鎂、氯化鈣、氯化鉀和目標DNA反應得到DNA儲備液，pH值為7.0-8.0；

(4)、將定制DNA的H2序列和定制DNA的H1序列分別溶解在步驟(3)的DNA儲備液中，將溶解的H1序列和H2序列加熱，并以1℃/min的速率冷卻至室溫，形成穩定的H1發夾結構和H2發夾結構；將硫堇加入步驟(3)的DNA儲備液中，得到硫堇溶液；

(5)、將步驟(4)中H1發夾結構和H2發夾結構分別加入鹽酸三-(2-羧乙基)膦溶液以激活發夾中的巰基基團，得到巰基基團活化的H1發夾溶液和H2發夾溶液；將所述H2發夾溶液與步驟(2)中的組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金儲備液混合，得到第一混合液，將氯化鈉和十二烷基硫酸鈉依次加入所述第一混合液中，得到含有氯化鈉和十二烷基硫酸鈉的第二混合液，并將所述第二混合液孵育，然后離心，用步驟(3)的DNA儲備液洗滌2-5次，去除未反應的物質，將收集的H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金雜合物固體重新分散在步驟(3)中的DNA儲備液中，最后將此溶液超聲得到H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金雜合物溶液；

(6)、將步驟(5)中H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金雜合物溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺溶液中，然后在空氣浴振動器中孵育50-120min，得到活化的H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金雜合物溶液，將所述活化的H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金雜合物溶液加入步驟(4)的硫堇溶液中，然后在空氣浴振動器中孵育6-20h，之后離心收集，得到H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金-硫堇固體，并用步驟(3)的DNA儲備液洗滌2-5次，將清洗的H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金-硫堇固體再分散在步驟(3)的DNA儲備液中，然后超聲得到H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金-硫堇原液；

(7)、將目標DNA和步驟(6)的H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金-硫堇原液混合，得到目標DNA和H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金-硫堇混合液；

(8)、將金電極用麂皮打磨，接下來用乙醇和超純水清洗干凈，然后用氮氣吹干，在干凈的金電極上滴加步驟(5)中的巰基基團活化的H1發夾溶液，37℃溫育孵化30-80min，接著在電極上滴加6-巰基己-1-醇孵育30-80min，封閉電極上未反應的活性位點，孵育結束后用PBS緩沖液清洗電極并用氮氣吹干得到適體傳感器；

(9)、將步驟(7)中目標DNA和H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金-硫堇混合液滴加到適體傳感器上，37℃溫育孵化60min后，用磷酸緩沖液洗滌并用氮氣干燥，得到基于金-石墨烯量子點復合材料的電化學生物傳感器；

步驟(4)中，所述定制DNA的H1序列如SEQ ID NO.2所示；

步驟(4)中，所述定制DNA的H2序列如SEQ ID NO.3所示；

步驟(4)中，所述加熱的溫度為60℃，加熱的時間為5min；

步驟(3)和步驟(7)中，所述目標DNA的序列如SEQ ID NO.1所示；

步驟(1)中，所述反應的溫度為150-200℃，加熱的時間為0.5-2h；

步驟(2)中，所述離心的轉速為3000-10000rpm，離心的時間為5-30min；

步驟(5)中，所述孵育的溫度為15-30℃，孵育的時間為6-48h；離心的轉速為5000-16000rpm，離心的時間為5-30min；所述超聲的時間為20-60s；

步驟(6)中，所述空氣浴振動器的轉速為150-500rpm，溫度為15-37℃；離心的轉速為5000-16000rpm，離心的時間為5-30min；所述超聲的時間為20-60s；

步驟(7)中，所述混合的時間為10-30min；

步驟(5)中，所述H2-組氨酸/色氨酸石墨烯量子點-金雜合物固體和步驟(8)中制備的適體傳感器在使用前需保存在2-8℃的冰箱中。