[發明專利]一種人臍帶間充質干細胞制劑及其應用在審
| 申請號： | 202110455279.2 | 申請日： | 2021-04-26 |
| 公開（公告）號： | CN113197917A | 公開（公告）日： | 2021-08-03 |
| 發明（設計）人： | 張京鐘;余爽;杜方舟 | 申請（專利權）人： | 蘇州京賽諾生物科技有限公司 |
| 主分類號： | A61K35/28 | 分類號： | A61K35/28;A61K49/00;A61P3/10;A61P17/02;C12N5/10;C12N15/867;C12N15/65 |
| 代理公司： | 蘇州知途知識產權代理事務所(普通合伙) 32299 | 代理人： | 孫占莉 |
| 地址： | 215010 江蘇省蘇州市*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 臍帶 間充質 干細胞 制劑 及其 應用 | ||
1.一種用于促進皮膚創面愈合的hUC-MSCs細胞制劑，其特征在于，包含hUC-MSCs細胞和纖維蛋白凝膠；其中，所述纖維蛋白凝膠用作hUC-MSCs細胞移植時的支架。
2.根據種權利要求1所述的細胞制劑，其特征在于，每1×106個hUC-MSCs細胞用5～20μl濃度為5～30mg/ml的纖維蛋白原溶液重懸。
3.一種權利要求1～2任意一項所述的細胞制劑在制備哺乳動物皮膚創面愈合藥物中的應用，優選地，在制備治療糖尿病皮膚慢性潰瘍藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，包括：用纖維蛋白原溶液重懸hUC-MSCs細胞，然后將其均勻滴加至創面，隨后在創面處均勻滴加等體積的凝血酶溶液，待成膠后粘上敷貼用以維持細胞存活所需的濕潤無菌環境。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述纖維蛋白原溶液的濃度為5～30mg/ml，所述凝血酶溶液濃度為20～50U/ml。
6.一種帶有綠色熒光標記的人臍帶間充質干細胞(EGFP-hUC-MSCs細胞)，其特征在于，由人臍帶間充質干細胞用EGFP標記得到；其中，所述EGFP為增強綠色熒光蛋白。
7.根據權利要求6所述的EGFP-hUC-MSCs細胞，其特征在于，通過以下方法制備得到：
S1：從臍帶中分離人臍帶間充質干細胞進行消化傳代；
S2：將人臍帶間充質干細胞進行擴增培養及鑒定；
S3：構建EGFP標記的hUC-MSCs細胞，即得EGFP-hUC-MSCs細胞。
8.根據權利要求7所述的EGFP-hUC-MSCs細胞，其特征在于，S1包括以下步驟：
S1-1：將臍帶中的血液用生理鹽水沖洗干凈，剪成小段，完全浸泡于“PBS+雙抗”保存液中；
S1-2：用含1％雙抗的PBS溶液沖洗臍帶表面；
S1-3：分離臍動脈、臍靜脈以及臍帶表面的外膜，將臍帶切成小段，于培養箱中培養，細胞長至80％-90％融合率時，開始消化傳代；
S2包括以下步驟：
S2-1：將S1消化傳代得到的細胞群體在含有10％胎牛血清的DMEM/F12培養基中培養；
S2-2：細胞長至80％～85％融合率時，取出兩份分別更換成脂誘導培養基和骨誘導培養基培養，并分別進行油紅O染色分析和茜素紅S染色分析；
S2-3：離心收集細胞，流式檢測CD34、CD45、CD90和CD105指標；
S3包括以下步驟：
S3-1：取指數生長期的293T細胞傳至大皿中，細胞數在70％-80％，37℃、5％CO2培養箱培養過夜；
S3-2：取2個EP管，在一號管中將Lipo 2000加入OptiMEM中混勻后靜置，在二號管中將Plvx-EGFP、VSV-G、PMDL、RSV慢病毒質粒加入OptiMEM中混勻后靜置，將一號管中液體滴加至二號管，混勻后室溫靜置；
S3-3：將步驟S3-2靜置后的液體滴加至預熱的DMEM+10％FBS培養基中，混勻，棄去細胞舊液，將混合物沿壁滴加至大皿中，補充新鮮完全培養基進行培養，然后收集病毒液并離心收集上清液；
S3-4：將LentiX濃縮液與S3-3收集的上清液混合，放置過夜后離心棄上清，留灰白色沉淀；
S3-5：使用冷PBS重懸灰白色沉淀，直接感染人臍帶間充質干細胞，獲得EGFP-hUC-MSCs細胞。
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