[發明專利]一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的引物探針組

在審

• 申請號: 202110452444.9
• 申請日: 2021-04-26
• 公開（公告）號: CN113073149A
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 張玉坤;陳大為;陳龍;張瑤
• 申請（專利權）人: 濟南國益生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 濟南信在專利代理事務所(特殊普通合伙) 37271
• 代理人: 黃波

1.一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的引物探針組，其特征在于，包括檢測人腺病毒的引物對及對應的探針，其中，引物和探針序列為：

ADV-F：

5’-TAAGGCTAATGGCAATGGCGCAGGTGATAATGG-3’；

ADV-R：

5’-[Biotin]GGTTGTCAGATATTTCCACGTTGGTGGGGTTGT-3’；

ADV-P：

5’-[FAM]AGAAATTTCCTTTACTCCAATATTGCACTA[dSpacer]ACCTGCCAGACAAGCT[C3-spacer]-3’。

2.如權利要求1所述的一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的引物探針組，其特征在于，所述下游引物的5’端用Biotin標記；探針的5’端用FAM標記，第31個堿基替換為THF(dSpacer)，3’末端被阻斷基團C3-spacer修飾；擴增產物大小不超過500bp。

3.如權利要求1所述的一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的試劑盒，其特征在于，該試劑盒中包括有：含有擴增反應試劑的檢測管、緩沖液、醋酸鎂、標準陽性質粒、無菌雙蒸水、側流層析檢測試紙條。

4.如權利要求3所述的一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的試劑盒，其特征在于，所述擴增反應試劑單管分裝，為干粉形態，包括RMA引物對及檢測探針組、重組酶、UvsY蛋白、單鏈結合蛋白、DNA聚合酶、核酸內切酶IV。

5.如權利要求4所述的一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的試劑盒，其特征在于，所述重組酶是來自大腸桿菌的解旋蛋白RecA蛋白，它的功能是介導模板的解鏈以及實現模板和引物之間的鏈替換；所述UvsY蛋白是一種輔助蛋白，可以協助或增強重組酶活性，是來自T4或T6噬菌體等的重組蛋白；所述單鏈結合蛋白為來自大腸桿菌或T4噬菌體的GP32蛋白，可以局部結合被替換出來的同源DNA單鏈，避免其被核酸酶降解；所述DNA聚合酶是Bst聚合酶，具有鏈置換活性，但不耐高溫，因此非常適合在常溫恒溫條件下反應；所述核酸內切酶IV可以識別并切割探針上的脫堿基位點(dSpacer)，產生新的羥基末端。

6.如權利要求5所述的一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的試劑盒，其特征在于，所述緩沖液包括下述組分：Tris、聚環氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

7.如權利要求6所述的一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的試劑盒，其特征在于，所述引物對及檢測探針組在擴增體系中的終濃度分別為10μM；所述醋酸鎂的終濃度為100mM；所述Tris的終濃度為50mM；所述聚環氧乙烷的終濃度為10％w/v；所述海藻糖的終濃度為2mM；所述甘露醇的終濃度為2.5mM；所述ATP的終濃度為10mM；所述dNTPs的終濃度為2mM；所述肌酸激酶的終濃度為1000ng/mL；所述磷酸肌酸的終濃度為25mM；所述大腸桿菌RecA蛋白的終濃度為100ng/μL；所述UvsY蛋白的終濃度為40ng/μL；所述單鏈結合蛋白GP32的終濃度為800ng/μL；所述Bst聚合酶的終濃度為60ng/μL；所述核酸內切酶IV的終濃度為80ng/μL。

8.如權利要求7所述的一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的試劑盒，其特征在于，所述標準陽性質粒為含有ADV基因片段的重組質粒，用于ADV核酸檢測的陽性對照。

9.如權利要求8所述的一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的試劑盒，其特征在于，所述無菌雙蒸水為陰性對照，與標準陽性質粒一起檢驗相應的反應體系和反應條件能否正常反應，所述試劑盒可以檢測的樣品為咽拭子、鼻咽拭子。

10.如權利要求9所述的一種基于LFD-RMA法檢測人腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)提取待測樣本的DNA；

(2)設計用于ADV檢測的引物對及探針；

(3)以提取的待測樣本DNA作為模板，加入上述試劑盒中的擴增反應試劑進行RMA擴增反應。擴增反應在恒溫水浴鍋中進行，反應條件為：40℃水浴5min后，混勻，再40℃水浴15min；

(4)應用側流層析試紙條進行擴增產物的檢測：當試紙條出現兩條條帶，一條位于質控區內，一條位于檢測區，則結果為陽性，表明樣本中含有ADV；當試紙條只有質控區出現一條條帶，檢測區沒有條帶，則結果是陰性，表明樣本中不含有ADV。