[發明專利]肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法

在審

• 申請號: 202110452400.6
• 申請日: 2021-04-26
• 公開（公告）號: CN112899270A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 易康;王宗秀
• 申請（專利權）人: 南京諾因生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京禾易知識產權代理有限公司 32320
• 代理人: 張松云

本發明提出了一種肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法，包括如下步驟：S1、差異裂解去宿主：取樣離心棄上清，重懸于PBS溶液中，加入皂素溶液孵育后加入無菌水再次孵育；加入NaCl震蕩均勻后離心棄上清，重新懸浮于PBS溶液中；S2、去除宿主DNA：向S1中所得溶液中加入PMA溶液，經歷黑暗孵育以及光照孵育；S3、微生物菌體破壁：采用研磨珠以及溶菌酶對S2中得到的溶液進行破壁處理；S4、核酸提取：對S3得到的溶液進行DNA提取，并檢測質量。本發明通過使用疊氮溴化丙錠(PMA)。當暴露在可見光下時，PMA分子的疊氮基被光解裂解，并發生C?H插入反應，與DNA形成共價鍵，可有效地從下游分析中消除任何暴露的DNA。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，尤其涉及一種肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法。

背景技術

全面檢測、無偏好性的宏基因組二代測序(mNGS)在傳染病診斷方面具有強大的優勢，因為不需要特殊探針和靶向引物，從而有助于快速檢測病原體。隨著成本和時間的持續減少，mNGS越來越多地用于臨床診斷。然而，由于宿主DNA的高背景大大降低了病原體的序列覆蓋率，在大多數臨床標本中，人類DNA污染仍然是mNGS中病原體檢測的主要挑戰。先前對急性下呼吸道感染患者鼻咽抽吸物進行的宏基因組學研究表明，高達95％的原始NGS讀數是人類DNA?？墒褂蒙逃迷噭┖泻鸵寻l布的方法(包括差異裂解，去除人類DNA和微生物DNA富集方法)進行去宿主處理，但它們在復雜的呼吸道樣本中表現不佳，需要更好的方法。

當前去除宿主DNA的方法可分為兩大類：在DNA提取之前起作用的方法和在提取后作用于DNA的方法。第一種方法通常遵循兩步過程：第一步是選擇性裂解哺乳動物細胞；第二步通過酶去除暴露的DNA，僅留下完整的微生物細胞用于下游分析。雖然成本較低，但對樣本要求較高，會引起提取得到的微生物樣本量不足等問題。第二種方法主要有兩種形式的處理方法：一種方法是針對甲基化核苷酸，但這種方法不適用于具有與宿主相似的甲基化模式的真核微生物；另一種方法是利用CRISPR/Cas9針對宿主特異性序列進行基于雜交的缺失，這種方法已經成功地應用于高度重復的rRNA序列，但不容易適應基因組規模的序列耗盡。

因此急需提供一種應用于呼吸道樣本，兼容性好，提取效果好、效率高，成本低的病原微生物宏基因組去宿主化核酸提取方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術存在的缺陷，本發明提出了肺泡灌洗液病原微生物宏基因組去宿主化核酸提取方法，對臨床標本進行預處理，以選擇性地消耗人類DNA，同時將對病原體DNA的影響降至最低。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法，包括如下步驟：

S1、差異裂解去宿主：取樣離心棄上清，重懸于PBS溶液中，加入皂素溶液孵育后加入無菌水再次孵育；加入NaCl震蕩均勻后離心棄上清，重新懸浮于PBS溶液中；

S2、去除宿主DNA：向S1中所得溶液中加入PMA溶液，經歷黑暗孵育以及光照孵育；

S3、微生物菌體破壁：采用研磨珠以及溶菌酶對S2中得到的溶液進行破壁處理；

S4、核酸提取：對S3得到的溶液進行DNA提取，并檢測質量。

進一步地，所述S1中差異裂解去宿主具體包括如下步驟：

S11、將肺泡灌洗液樣品(400μL)以10,000g離心5min，去掉上清液，并將沉淀重新懸浮在200μLPBS中；

S12、加入5％皂苷溶液，震蕩混勻并在室溫下孵育10min；

S13、孵育后，添加300μL無菌水，并在室溫下繼續孵育30s，然后添加10μL 5MNaCl，振蕩混勻；