[發明專利]肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法

在審

• 申請號: 202110452400.6
• 申請日: 2021-04-26
• 公開（公告）號: CN112899270A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 易康;王宗秀
• 申請（專利權）人: 南京諾因生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京禾易知識產權代理有限公司 32320
• 代理人: 張松云

1.一種肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、差異裂解去宿主：取樣離心棄上清，重懸于PBS溶液中，加入皂素溶液孵育后加入無菌水再次孵育；加入NaCl震蕩均勻后離心棄上清，重新懸浮于PBS溶液中；

S2、去除宿主DNA：向S1中所得溶液中加入PMA溶液，經歷黑暗孵育以及光照孵育；

S3、微生物菌體破壁：采用研磨珠以及溶菌酶對S2中得到的溶液進行破壁處理；

S4、核酸提取：對S3得到的溶液進行DNA提取，并檢測質量。

2.根據權利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述S1中差異裂解去宿主具體包括如下步驟：

S11、將肺泡灌洗液樣品(400μL)以10,000g離心5min，去掉上清液，并將沉淀重新懸浮在200μLPBS中；

S12、加入5％皂苷溶液，震蕩混勻并在室溫下孵育10min；

S13、孵育后，添加300μL無菌水，并在室溫下繼續孵育30s，然后添加10μL 5M NaCl，振蕩混勻；

S14、10,000g離心5min，除去上清液，然后將沉淀重懸于200μl PBS中。

3.根據權利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述皂苷溶液的最終濃度為2.5％。

4.根據權利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述S2中去除宿主DNA具體包括如下步驟：

S21、向溶液中添加疊氮溴化丙錠，并將樣品短暫渦旋，然后在黑暗中于室溫條件下孵育10min；

S22、孵育后，將溶液于冰上水平放置30min，并距離標準臺式熒光燈20cm。在此期間，每5min短暫離心并旋轉一次。

5.根據權利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述疊氮溴化丙錠的最終濃度為10μM。

6.根據權利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述S3中微生物菌體破壁具體包括如下步驟：

S31、將溶液以5000g離心15min，棄上清液；

S32、將沉淀重懸于400μl PBS中，并添加250mg破壁珠、10uL 20mg/ml溶菌酶；

S33、振蕩混勻，37℃下孵育15min。

7.根據權利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因組去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述S4中采用商用核酸抽提試劑盒進行DNA抽提及純化。