[發明專利]一種香蕉炭疽病菌的分離方法

有效

• 申請號: 202110451295.4
• 申請日: 2021-04-19
• 公開（公告）號: CN113174335B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發明（設計）人: 張容博;張君成;王忠文
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種香蕉炭疽病菌（ Colletotrichum musae ） 的分離方法，其特征是，采用一種特制的孢子離散絲，直接從香蕉炭疽病標樣中將單個分生孢子分離出來，培養形成一個遺傳組成單一的香蕉炭疽病菌菌株，分離培養的操作步驟如下：

1)香蕉炭疽病標樣的準備：將普通熟化處理的香蕉果實進行常規保濕培養，直至香蕉果上潛伏侵染的炭疽病發展成典型的病斑及孢子粘液，作為待分離病菌的香蕉炭疽病標樣；

2)孢子離散絲的制備：取出1000μl普通移液槍的槍頭，將槍頭的尖端放在火焰上灼燒，槍頭尖端燃火處熔化，安全熄火后，用尖頭鑷子夾住一點熔化的槍頭，輕輕拉長，至形成一根發絲狀的細絲，冷卻后剪去多余的細絲，形成一支分離香蕉炭疽病菌分生孢子使用的孢子離散絲，該離散絲包括滑動絲(a)、絲柄(b)部分；

3)孢子離散板的制備：

①瓊脂平板基質的制備：按照瓊脂15g、水1000ml的配比，配制含有常規營養的瓊脂基質，常規高溫高壓滅菌后，成為瓊脂平板基質備用；

②瓊脂平板的倒制與平板表層凈化：將操作①制備的瓊脂平板基質加熱充分熔化，趁熱倒入培養皿制成薄層平板，并將該熱液狀的平板置于能繼續保持熱液狀的保溫裝置內，保溫靜置20分鐘以上，然后將該靜置的液狀薄層平板，平穩轉移到無菌工作臺面，待液狀薄層平板冷凝后，成為表層凈化的瓊脂平板；

③孢子離散板的切制與裝片：用滅菌刀片將操作②制成的瓊脂平板，切割成長條狀的瓊脂條塊，該瓊脂條塊就是起分散孢子作用的離散板；用滅菌刀片將該離散板挑起裝放到滅菌載玻片上，成為備待分散孢子用的離散板(c)；

4)分生孢子的離散：將步驟2)制備的孢子離散絲進行常規表面消毒和清潔，然后手執孢子離散絲的絲柄(b)，將滑動絲(a)的端部，在步驟1)準備的標樣病斑表面輕輕點觸孢子粘液而粘附分生孢子，將粘有孢子的滑動絲(a)轉移到步驟3)準備的孢子離散板(c)的一端，并貼放于離散板面上，沿著離散板面滑移滑動絲(a)，滑動絲(a)在離散板面的相對滑動，導致滑動絲(a)上粘附的孢子脫開散落在離散板面上；

5)載有單孢子小方塊的切取：將步驟4)得到的載有分生孢子的離散板(c)，置于顯微鏡下觀察，沿著滑動絲(a)的滑動軌跡尋找離散的孢子，找出單一出現的孢子，選擇與左右相鄰孢子間隔距離遠的單一孢子，用滅菌刀片將該單一孢子左右的離散板(c)切斷及移開，得到只載有唯一1個分生孢子的小方塊；

6)單孢子分離菌株的形成：用刀片將步驟5)切出的載有單一分生孢子的小方塊，轉移到香蕉炭疽病菌的常規培養基上，常規培養，直到孢子萌發生長形成單孢子菌落；移植單孢子菌落的菌絲擴大繁殖，形成香蕉炭疽病菌單孢子分離菌株。