[發明專利]一種香蕉炭疽病菌的分離方法

有效

• 申請號: 202110451295.4
• 申請日: 2021-04-19
• 公開（公告）號: CN113174335B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發明（設計）人: 張容博;張君成;王忠文
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種香蕉炭疽病菌的分離方法。該方法采用一種特制的孢子離散絲，直接從香蕉炭疽病標樣中將單個分生孢子分離出來，培養形成一個遺傳組成單一的香蕉炭疽病菌菌株。分離培養的實施操作步驟如下：1)香蕉炭疽病標樣的準備；2)孢子離散絲的制備；3)孢子離散板的制備；4)分生孢子的離散；5)載有單孢子小方塊的切取；6)單孢子分離菌株的形成。本發明具有如下優點：1)分離孢子用的關鍵器具簡單易制，分離操作簡單易行；2)分離與取得單孢菌株能一次到位；3)分離工作耗工少耗時短；4)能顯著提高香蕉炭疽病菌分離的工作效率及分離結果的可靠性。

技術領域

本發明涉及植物病理學技術。具體是一種香蕉炭疽病菌的分離方法。

背景技術

香蕉炭疽病是我國香蕉產業的一種重大病害，該病害由香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)侵染引起。開展香蕉炭疽病菌的生物學研究是香蕉炭疽病防控的重要基礎。而開展香蕉炭疽病菌生物學研究的前提，必需要擁有香蕉炭疽病菌材料。一般實驗室往往需要從病害標樣中分離獲得香蕉炭疽病菌。

香蕉炭疽病菌群體的遺傳組成復雜，不同菌株的生物學特性及致病性往往存在較大差異。正常的研究通常需要取得遺傳組成單一的香蕉炭疽病菌材料，或者說單克隆菌株材料。本領域一般認為由單一孢子生長形成的菌株材料屬遺傳組成單一的病菌材料。因此香蕉炭疽病菌的分離菌株材料一般需要獲得單孢分離菌株材料。

至今公開的香蕉炭疽病菌的分離方法，主要是常規的組織分離培養方法和分生孢子稀釋分離培養方法。

組織分離培養方法的主要技術特征是，需要將帶菌組織進行表面消毒，再將消毒后的組織塊轉移到培養基上培養。該方法容易被腐生雜菌污染，重要的是分離獲得的純培養菌一般不屬于遺傳組成單一的香蕉炭疽病菌。

分生孢子稀釋分離培養方法主要技術特征是，將發病部位的分生孢子洗滌到水介質中，并對孢子懸浮液進行適度的稀釋分散，再通過微量移液槍、或毛細管、或移植針等器具，將懸浮液中的孢子分開，挑取單個分生孢子進行培養。這類方法需要實施孢子液的孢子定量及稀釋操作過程，比較費時費工，而且很容易出現雜菌污染而影響分離工作的效率與效果。

發明內容

本發明的目的是，提供一種分離培養獲得遺傳組成單一的香蕉炭疽病菌純培養的分離方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種香蕉炭疽病菌的分離方法，采用一種特制的孢子離散絲，直接從香蕉炭疽病標樣中將單個分生孢子分離出來，培養形成一個遺傳組成單一的香蕉炭疽病菌菌株，分離培養的操作步驟如下：

1.香蕉炭疽病標樣的準備：將普通熟化處理的香蕉果實進行常規保濕培養，直至香蕉果上潛伏侵染的炭疽病發展成典型的病斑及孢子粘液，作為待分離病菌的香蕉炭疽病標樣。

2.孢子離散絲的制備：取出1000μl普通移液槍的槍頭，將槍頭的尖端放在火焰上灼燒，槍頭尖端燃火處熔化，安全熄火后，用尖頭鑷子夾住一點熔化的槍頭，輕輕拉長，至形成一根發絲狀的細絲，冷卻后剪去多余的細絲，形成一支分離香蕉炭疽病菌分生孢子使用的孢子離散絲，該離散絲包括滑動絲a、絲柄b部分。

3.孢子離散板的制備：

①瓊脂平板基質的制備：按照瓊脂15g、水1000ml的配比，配制含有常規營養的瓊脂基質，常規高溫高壓滅菌后，成為瓊脂平板基質備用。

②瓊脂平板的倒制與平板表層凈化：將操作①制備的瓊脂平板基質加熱充分熔化，趁熱倒入培養皿制成薄層平板，并將該熱液狀的平板置于能繼續保持熱液狀的保溫裝置內，保溫靜置20分鐘以上，然后將該靜置的液狀薄層平板，平穩轉移到無菌工作臺面，待液狀薄層平板冷凝后，成為表層凈化的瓊脂平板。