[發明專利]一種鑒別豬偽狂犬病毒基因缺失疫苗株和野毒株的熒光定量PCR檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202110449294.6
• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN113136456A
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 湯細彪;黃超;黃英;陳翔鴻;謝思思;楊柳;宋文博;賈雙;龍云志;李倩倩;劉錦錦;梁鞏
• 申請（專利權）人: 武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 錢云

本發明涉及動物病疫檢測領域，具體涉及一種鑒別豬偽狂犬病毒基因缺失疫苗株和野毒株的熒光定量PCR檢測試劑盒。在本發明提供的檢測試劑盒中，用于檢測豬偽狂犬病毒gI/gE基因缺失情況的引物及探針如SEQ ID NO.1?3所示。本發明提供的檢測試劑盒中還包括，基于化學法修飾的熱啟動DNA聚合酶、dUTP/UNG防污染系統、抗PCR抑制物因子。本發明提供的檢測試劑盒敏感性高，最低檢測限為189copies/uL。本發明所述試劑盒適用于復雜的動物臨床樣本的檢測。

技術領域

本發明涉及動物病疫檢測領域，具體涉及一種鑒別PRV的gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株的熒光定量檢測試劑盒。

背景技術

偽狂犬病(Pseudorabies,PR或Aujeszky’s disease,AD)是一種由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的多種家畜和野生動物共患的急性、熱性傳染病。偽狂犬病毒能引起豬發生亞臨床感染和潛伏感染，但臨床癥狀因日齡不同而異，仔豬常表現高熱，食欲廢絕，流涎，呼吸困難，震顫和腹瀉等癥狀，繼而出現運動失調，間歇性抽搐，昏迷直至死亡(15日齡以內仔豬死亡率常高達100％，斷奶仔豬死亡率為10％～20％)；育肥豬僅表現輕微的呼吸道癥狀，增重減緩等；母豬表現返情，屢配不孕，妊娠母豬常表現流產，產死胎和木乃伊；公豬則常出現睪丸腫脹，萎縮等，種用性能降低或喪失。

PRV是一種抵抗力較強的皰疹病毒，有多種蛋白質，在這些蛋白質中，包膜成分蛋白質gB,gC誘導細胞和體液免疫應答，gE蛋白是一個主要的毒力蛋白，能夠促進感染細胞和未感染細胞的融合，是病毒入侵中樞神經的必需致病因子。由于gE基因缺失的弱毒疫苗比單獨缺失其他基因的PRV疫苗更為安全，所以目前歐盟和美國都規定只準使用gE基因缺失的疫苗。目前所知1200多個偽狂犬病野生毒株，全部含有gE基因，所以gE蛋白抗體有無是鑒別野毒和疫苗株的重要依據。目前認為，gE和gI蛋白共同形成一個非共價結合的復合體，該復合體存在于被感染的細胞膜和病毒囊膜中，該復合體對于PRV在神經系統的侵襲和傳播起到一定的作用，但是，gE和gI蛋白沒有共同的抗原決定簇。

實時熒光定量PCR技術(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。實時熒光定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域。與常規PCR相比該技術可快速、靈敏的檢測病毒RNA和DNA以及細菌DNA。

發明內容

本發明的目的是提供一種鑒別區分PRV的gI/gE基因缺失株與野毒株的方法。尤其是，提供一種鑒別區分PRV野毒株與HB98和HB2000基因缺失株的方法。

科前公司的HB98和HB2000為PRV的gI和gE基因部分缺失的疫苗，市面已有的熒光定量檢測試劑盒不能檢測區分科前生物股份有限公司的HB98和HB2000(gI和gE基因缺失)疫苗株，可能原因是這兩個疫苗株缺失的核苷酸序列相對較少，且病毒變異的風險客觀存在。本發明利用自主設計的引物和探針建立了豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的鑒定、檢測方法。

為了準確、規范、快速、高效的對豬場進行偽狂犬病毒野毒和gI/gE基因缺失疫苗株的鑒別診斷，本發明提供基于TaqMan的實時熒光定量PCR(qPCR)提供對豬偽狂犬病毒野毒病原和gI/gE基因缺失疫苗株進行區分的方法。

為了實現本發明的目的，第一方面，本發明提供熒光定量PCR檢測鑒別豬偽狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株和野毒株的引物和探針，其中，用于鑒別gI/gE基因缺失的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；用于鑒別gI/gE基因缺失的TaqMan探針核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

具體地，本發明提供的引物和探針，主要適用于鑒別豬偽狂犬病毒gI/gE基因缺失疫苗株HB98和HB2000，本發明所提供的引物擴增所得片段位于gI和gE基因的連接處。