[發(fā)明專利]一種新型檢測腫瘤組織中腫瘤抗原OVA12表達水平的方法

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• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN113433321A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設計）人: 張仁峰
• 申請（專利權）人: 山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院（山東省立醫(yī)院）
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/574;C07K16/30;C07K1/16
• 代理公司: 蘇州中合知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 李斌

一種新型檢測腫瘤組織中腫瘤抗原OVA12表達水平的方法，包括如下步驟：步驟一：收集不同類型及病理分期的腫瘤組織及相應癌旁組織標本，應用兩株OVA12特異性單抗，采用免疫組化技術檢測OVA12抗原表達水平，分析OVA12抗原在不同類型腫瘤組織、相應癌旁組織表達水平差異及其與腫瘤臨床病理分期的相關性；步驟二：應用組織芯片技術對步驟一的腫瘤組織內(nèi)OVA12表達水平進行再驗證，建立臨床腫瘤組織OVA12抗原標準化免疫組化檢測方法。本發(fā)明通過建立新型標準化免疫組化檢測技術，分析不同類型腫瘤病人OVA12抗原分布水平/特征，及其與腫瘤分期的相關性，為臨床腫瘤診斷提供新的高特異性和高敏感性檢測指標。

技術領域

本發(fā)明涉及醫(yī)療診斷技術領域，具體涉及一種新型檢測腫瘤組織中腫瘤抗原OVA12表達水平的方法。

背景技術

腫瘤抗原是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中一系列腫瘤相關基因異常表達的產(chǎn)物。尋找和鑒定新的腫瘤抗原，具有非常重要的理論意義和臨床應用價值：一方面，腫瘤抗原可以激發(fā)機體的細胞和體液免疫應答，可為腫瘤疫苗的研發(fā)提供新的依據(jù)，為腫瘤的早期診斷及預后評估提供重要的檢測指標；另一方面，大部分腫瘤抗原在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學功能，明確其作用機制，可為臨床腫瘤治療提供新的研究靶點，為篩選新的抗腫瘤藥物提供重要的研究依據(jù)。

腫瘤抗原OVA12是通過重組cDNA表達文庫血清學分析技術(SEREX)構建卵巢癌cDNA文庫篩選得到的一個新的基因；由于該基因發(fā)現(xiàn)于卵巢癌，其分子量為12KD，故將其命名為腫瘤抗原OVA12。該基因定位于人染色體9q34.3，mRNA全長939bp，含有345bp的開放讀碼框，編碼114個氨基酸，等電點為8.95。該抗原主要定位于細胞漿；在多種腫瘤細胞中高表達，而在正常細胞株中不表達或低表達。收集臨床不同來源腫瘤組織和相應癌旁組織，應用免疫組化技術檢測OVA12抗原表達水平，結果顯示，與癌旁組織相比，OVA12在腫瘤組織中呈特征性高表達，而且與腫瘤的分期呈正相關。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明一種新型檢測腫瘤組織中腫瘤抗原OVA12表達水平的方法應用雜交瘤技術及親和層析技術，獲得兩株高純度抗OVA12單抗(B11F8和B10B9)；并通過建立新型標準化免疫組化檢測技術，分析不同類型腫瘤病人OVA12抗原分布水平/特征，及其與腫瘤分期的相關性，為臨床腫瘤診斷提供新的高特異性和高敏感性檢測指標。

本發(fā)明技術方案如下：

一種新型檢測腫瘤組織中腫瘤抗原OVA12表達水平的方法，包括如下步驟：

步驟一：收集不同類型及病理分期的腫瘤組織及相應癌旁組織標本，應用兩株OVA12特異性單抗，采用免疫組化技術檢測OVA12抗原表達水平，分析OVA12抗原在不同類型腫瘤組織、相應癌旁組織表達水平差異及其與腫瘤臨床病理分期的相關性；

步驟二：應用組織芯片技術對步驟一的腫瘤組織內(nèi)OVA12表達水平進行再驗證，建立臨床腫瘤組織OVA12抗原標準化免疫組化檢測方法；

免疫組化技術的具體步驟為：

S1：組織切片；

S2：烤片過夜；

S3：脫蠟復水；

S4：加熱法(100℃)將切片置于檸檬酸緩沖液中進行抗原修復；

S5：修復完成后用5％的山羊血清進行封閉；

S6：加入80～120μl單抗B11F8和B10B9在4℃孵育過夜，同時用小鼠的正常IgG作為陰性對照；

S7：孵育完畢后充分洗滌；

S8：加入抗小鼠IgG的二抗室溫孵育1h；

S9：滴加DAB工作液顯色，顯色完全后用蒸餾水終止顯色；