[發明專利]一種新型檢測腫瘤組織中腫瘤抗原OVA12表達水平的方法

在審

• 申請號: 202110448567.5
• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN113433321A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 張仁峰
• 申請（專利權）人: 山東第一醫科大學附屬省立醫院（山東省立醫院）
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/574;C07K16/30;C07K1/16
• 代理公司: 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 李斌

1.一種新型檢測腫瘤組織中腫瘤抗原OVA12表達水平的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：收集不同類型及病理分期的腫瘤組織及相應癌旁組織標本，應用兩株OVA12特異性單抗，采用免疫組化技術檢測OVA12抗原表達水平，分析OVA12抗原在不同類型腫瘤組織、相應癌旁組織表達水平差異及其與腫瘤臨床病理分期的相關性；

步驟二：應用組織芯片技術對步驟一的腫瘤組織內OVA12表達水平進行再驗證，建立臨床腫瘤組織OVA12抗原標準化免疫組化檢測方法；

免疫組化技術的具體步驟為：

S1：組織切片；

S2：烤片過夜；

S3：脫蠟復水；

S4：加熱法(100℃)將切片置于檸檬酸緩沖液中進行抗原修復；

S5：修復完成后用5％的山羊血清進行封閉；

S6：加入80～120μl單抗B11F8和B10B9在4℃孵育過夜，同時用小鼠的正常IgG作為陰性對照；

S7：孵育完畢后充分洗滌；

S8：加入抗小鼠IgG的二抗室溫孵育1h；

S9：滴加DAB工作液顯色，顯色完全后用蒸餾水終止顯色；

S10：蘇木素復染90s；

S11：切片逐級脫水；

S12：中性樹膠封片，待樹膠完全干燥后，在顯微鏡下觀察并拍照，并進行組化結果評分。

2.根據權利要求1所述的一種新型檢測腫瘤組織中腫瘤抗原OVA12表達水平的方法，其特征在于，免疫組化技術的具體步驟為：

S1：將各器官的腫瘤組織切片及癌旁組織切片，

S2：將S1制得切片置于切片架中，于50-60℃烘箱中烤片過夜；

S3：將切片逐級脫蠟復水；

S4：使用PBS沖洗切片三次，每次3～6分鐘；

S5：抗原修復：將切片放入裝有抗原修復緩沖液的盒子中，將盒子置于100℃水浴中加熱，用煮沸法修復切片中的抗原表位，計時15～20分鐘，隨后調至保溫模式，計時4～5分鐘；

S6：取出盒子，讓切片在0.01mol/L檸檬酸緩沖液中自然冷卻至室溫，用PBS洗3次，每次3～6分鐘；

S7：取出切片，甩干并擦掉切片周圍的液體，平放于濕盒上，滴加5％的山羊血清于組織上，覆蓋住組織，室溫封閉10分鐘，用PBS洗3次，每次3～6分鐘；

S8：甩干并擦掉切片周圍的液體，平放于濕盒上，用無菌PBS將單抗B10B9、B11F8稀釋至濃度為9.5μg/ml，并以同樣濃度的小鼠正常IgG作為陰性對照，將不同的抗體分別取80～120μl加至同一組織切片上，覆蓋住組織，4℃孵育一抗過夜；

S9：用PBS洗3次，每次3～6分鐘，甩干并擦掉切片周圍的液體，平放于濕盒上；

S10：將二抗滴加于切片上，覆蓋住組織，于室溫下孵育1小時；

S11：用PBS洗3次，每次3～6分鐘，甩干并擦掉切片周圍的液體，平放于濕盒上；

S12：配好DAB工作液滴加于切片上，覆蓋住組織，室溫顯色，肉眼觀察顯色情況，待顯色完全后，用雙蒸水終止顯色；

S13：蘇木素復染90秒；

S14：切片逐級脫水，每級5分鐘；

S15：中性樹膠封片，待樹膠完全干燥后，在顯微鏡下觀察并拍照，并進行組化結果評分。

3.根據權利要求1或2所述的一種新型檢測腫瘤組織中腫瘤抗原OVA12表達水平的方法，其特征在于，所述OVA12單克隆抗體的制備包括如下步驟：

S1：將OVA12蛋白免疫小鼠后獲得的B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合后篩選得到雜交瘤細胞，通過有限稀釋法培養獲得單克隆細胞；

S2：雜交瘤細胞用10mlHT培養基稀釋至10個/ml，在96孔板中每孔加入100μl細胞懸液，培養14天后選擇單克隆生長的陽性孔至24孔板培養；

S3：培養14天后選擇陽性克隆至6孔板繼續培養，經若干次培養后獲得兩株單克隆細胞擴大培養；

S4：兩株單克隆細胞分別用無菌PBS重懸計數，注射至Balb/c小鼠腹腔，每只注射0.5ml，小鼠注射前兩天分別用0.5ml石蠟致敏；

S5：腹腔注射后一周抽小鼠腹水，13,000rpm/分鐘離心1分鐘，收集上清，-80℃保存腹水并測定效價。

4.根據權利要求1或2所述的一種新型檢測腫瘤組織中腫瘤抗原OVA12表達水平的方法，其特征在于，所述OVA12單克隆抗體的純化包括如下步驟：

S1：將柱子和各緩沖液平衡至室溫，將離心機的離心力設置為1000×g；

S2：將待純化的腹水冰上融化，并用2ml結合緩沖液Binding Buffer稀釋；

S3：將旋轉柱置于15ml無菌離心管中離心1分鐘，棄去流穿液，再放回于離心管中；

S4：向柱子中加入2ml Binding Buffer，離心1分鐘，棄去流穿液，重復一次以平衡柱子；

S5：將腹水樣品上柱，在室溫下翻轉混勻，孵育10分鐘；

S6：將旋轉柱置于一個新的15ml無菌離心管中，離心1分鐘，保存流穿液；

S7：將旋轉柱轉移至另一新的15ml無菌離心管中，加入2mlBinding Buffer離心1分鐘，重復洗3次；

S8：另取3支15ml無菌離心管，各加入100μl中和緩沖液Neutralization Buffer，將旋轉柱放置于其中一支離心管中，向柱子中加入1ml洗脫緩沖液離心1分鐘，將收集到的液體作為第一次洗脫的液體；再將柱子轉移至另外一支已加Neutralization Buffer的離心管中，重復上述步驟，分別收集第二次及第三次洗脫的液體；

S9：通過測定三次洗脫液在280nm波長處的OD值來鑒定純化的單抗的洗脫效果；

S10：BCA蛋白濃度測定法測定純化OVA12單抗的濃度。