[發明專利]一種產乳酰-N-新四糖的基因工程菌及生產方法

有效

• 申請號: 202110447082.4
• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN113136357B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 張濤;江波;胡苗苗;李夢麗
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/56;C12N15/54;C12N15/61;C12P19/26;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種產乳酰?N?新四糖的基因工程菌及生產方法，屬于代謝工程和食品生物技術領域。本發明為解決現有的利用微生物方法生產乳酰?N?新四糖產量較低的問題，通過對lgtA和lgtB的外源表達，合理組合調控乳酰?N?新四糖合成途徑中lacY，pgm，galE，galT和galK的過表達，敲除大腸桿菌宿主中的lacZ表達，并且優化培養過程中的碳源配置，從而達到了調控代謝通路的碳通量，提高乳酰?N?新四糖的產量的目的，在搖瓶實驗中，大腸桿菌生產乳酰?N?新四糖的能力由304mg/L提升至1031mg/L，為乳酰?N?新四糖的工業化生產奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及一種產乳酰-N-新四糖的基因工程菌及生產方法，屬于代謝工程和食品發酵技術領域。

背景技術

人乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)是母乳中僅次于乳糖和脂肪的第三大固體組分，在成熟乳中的含量為12-13g/L，而在初乳中可達22-23g/L，這是牛乳無法比擬的(牛乳寡糖＜1g/L)。HMOs可耐受嬰兒消化道內酶的水解，進而抵御胃腸道病原微生物的感染和維持胃腸道微生態平衡。乳酰-N-新四糖作為人乳寡糖中的一種重要寡糖，具有增強人體免疫力，調節腸道菌群，促進細胞成熟和加速傷口愈合等生物學功能。鑒于乳酰-N-新四糖的重要生物功能和生理活性，已經允許添加進商品化嬰幼兒配方奶粉中。然而從天然產物中分離提取所得到的量很少，遠不及研究的需要，因此通過人工合成的方法獲得該類化合物就成為最佳選擇。

目前報道的乳酰-N-新四糖的合成方法主要包括三種，分別是化學合成、酶法合成和發酵法合成。化學合成法存在反應步驟復雜、原材料價格昂貴等問題，造成生產成本較高不利于工業的大規模合成，且化學合成中使用的部分有毒試劑，使產品不宜用于食品添加劑。酶合成法需要昂貴的核苷酸糖作為底物，不利于乳酰-N-新四糖的大規模生產。而生物法可以利用廉價碳氮源和底物，實現乳酰N-新四糖的合成，且對環境不造成影響。因此，通過生物法制備乳酰N-新四糖受到了越來越多的關注。

目前的研究表明，利用微生物方法合成的乳酰-N-新四糖產量均較低，并不能達到工業化大規模生產的要求，因此，為了解決目前微生物生產的瓶頸，打造更高效的生產菌株是非常必要的。

發明內容

本發明為了解決現有微生物方法合成的乳酰-N-新四糖產量較低的問題，提供了一種產乳酰-N-新四糖的基因工程菌，所述基因工程菌沉默表達β-半乳糖苷酶基因lacZ，并過表達β-1， 3-乙酰葡萄糖胺轉移酶基因lgtA、β-1，4-半乳糖基轉移酶基因lgtB、磷酸葡萄糖突變酶基因 pgm、UDP-葡萄糖4-表異構酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿嘧啶轉移酶基因galT、半乳糖激酶基因galK和β-半乳糖苷通透酶基因lacY。

在本發明的一種實施方式中，所述β-1，3-乙酰葡萄糖胺轉移酶基因lgtA和β-1，4-半乳糖基轉移酶基因lgtB均來源于腦膜炎奈瑟球菌，所述β-1，3-乙酰葡萄糖胺轉移酶基因lgtA 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，β-1，4-半乳糖基轉移酶基因lgtB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發明的一種實施方式中，所述磷酸葡萄糖突變酶基因pgm、UDP-葡萄糖4-表異構酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿嘧啶轉移酶基因galT、半乳糖激酶基因galK、β-半乳糖苷通透酶基因lacY均來源于大腸桿菌K-12和β-半乳糖苷酶基因lacZ，磷酸葡萄糖突變酶基因pgm的 Gene ID為945271，UDP-葡萄糖4-表異構酶基因galE的Gene ID為945354，半乳糖-1-磷酸尿嘧啶轉移酶基因galT的Gene ID為945357，半乳糖激酶基因galK的Gene ID為945358，β- 半乳糖苷通透酶基因lacY的Gene ID為949083，β-半乳糖苷酶基因lacZ的GeneID為945006。