[發明專利]一種水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法

有效

• 申請號: 202110446363.8
• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN113189182B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 惠榮奎;陳衛江;李莓;范連益;曲亮;王同華;郭一鳴;劉新紅
• 申請（專利權）人: 湖南省作物研究所
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 蘇州拓云知識產權代理事務所(普通合伙) 32344
• 代理人: 王云峰

本發明適用于生物鑒定方法技術領域，提供了一種水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法。本發明采取水提取蛋白制備上樣，通過凝膠制備、點樣、電泳、卸板、染色、純度計算的步驟，實現水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法。該方法既可以克服油菜純度鑒定中檢驗周期長等缺陷，又比醇溶蛋白樣品遷移的速度快，鑒定效率高，而且提取液經濟環保，提取效率高，譜帶清晰，分辨率高，為甘藍型油菜雜交種種子純度快速鑒定提供了新的途徑。

技術領域

本發明屬于生物鑒定方法技術領域，尤其涉及一種水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法。

背景技術

種子純度是評價油菜種子質量以及質量分級的一項重要指標，目前，鑒定油菜種子純度的方法主要有田間種植鑒定、籽粒及幼苗形態鑒定法、生化鑒定法、DNA分子標記技術等方法。田間種植鑒定準確可靠，但檢驗周期長，一般需要一個生長季節；籽粒及幼苗形態鑒定法要求品種有比較特異的籽粒或農藝性狀，并且要求檢驗人員要有豐富的經驗，否則，鑒定的準確程度就會受到限制；DNA分子標記技術對操作復雜，且成本較高，生化鑒定法主要是通過電泳把種子或植株中的蛋白質或者同工酶分離出來，染色后進行圖譜差異分析，由于油菜中的蛋白質、同工酶具有豐富的多態性，檢測結果比形態鑒定更加準確，操作簡單，效率高，在油菜雜交種純度鑒定中有非常廣闊的應用，

研究表明，對不同農作物而言，往往適宜采用不同的種子蛋白電泳方法進行純度鑒定，目前，已有酯酶同工酶、醇溶蛋白電泳技術應用于雜交油菜種子鑒定工作，但是尚未有成功利用水溶蛋白電泳技術鑒定雜交油菜種子純度的報道。

發明內容

本發明實施例提供一種水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，旨在解決已有技術的不足，建立一種快速、準確的油菜種子純度檢測方法，為油菜制種提供技術保障。

本發明實施例是這樣實現的，一種水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，其步驟如下：

1)蛋白質提取：將用于鑒定的甘藍型油菜雜交種種子及其母本種子壓扁，每粒種子加純水35μl～40μl，100℃水浴5分鐘后，放置半小時，獲得提取液用于上樣；

2)凝膠制備：采用水平灌膠的方式組裝玻璃板，分離膠灌至離后玻璃板頂部3～4cm處，輕輕加一層蒸餾水覆蓋靜置30min以上；濃縮膠灌膠至玻璃板頂端，插好點樣梳，濃縮膠凝固后拔出點樣梳；

3)點樣：每粒種子取25μl提取液上樣；

4)電泳：步驟3)上樣完畢后，用電極緩沖液封樣，然后將電泳槽注滿電極緩沖液，滴加溴酚藍作指示劑，4-15℃條件下，每電泳槽20-40mA穩流電泳；30min后，調電流至50-70mA繼續穩流電泳，待指示劑至凝膠底部時結束電泳；

5)卸板、染色：電泳結束后，取出膠板，將分離膠轉移至染色液中染色30-40min后，置于觀片燈上讀帶；

6)純度計算：對比甘藍型油菜雜交種及其母本水溶蛋白譜帶的差異，統計制種樣中具有母本水溶蛋白電泳譜帶類型的個體數量；根據純度計算公式計算出甘藍型油菜雜交種種子純度，所述純度計算公式為：

水溶蛋白鑒定種子純度＝(1-母本帶型數量/總檢測種子數量)×100％。

步驟1)中所述用于鑒定的甘藍型油菜雜交種種子及其母本種子的選取采取四分法取樣，具體為，將用于鑒定的甘藍型油菜雜交種種子晃動均勻，取出9-11g，放在紙上，剔除癟粒及霉、爛種子，采用四分法取樣。

步驟1)中所述用于鑒定的甘藍型油菜雜交種種子優選為“灃油520”甘藍型油菜雜交種種子。

步驟2)中所述分離膠為：300g丙烯酰胺，8g亞甲基雙丙烯酰胺，ddH₂O定容至1000ml，4℃保存。