[發明專利]一種水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法

有效

• 申請號: 202110446363.8
• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN113189182B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 惠榮奎;陳衛江;李莓;范連益;曲亮;王同華;郭一鳴;劉新紅
• 申請（專利權）人: 湖南省作物研究所
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 蘇州拓云知識產權代理事務所(普通合伙) 32344
• 代理人: 王云峰

1.一種水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，其特征在于：其步驟如下：

1）蛋白質提取：將用于鑒定的甘藍型油菜雜交種種子及其母本種子壓扁，每粒種子加純水35μl~40μl，100℃水浴5分鐘后，放置半小時，獲得提取液用于上樣；

2）凝膠制備：采用水平灌膠的方式組裝玻璃板，分離膠灌至離后玻璃板頂部3~4cm處，輕輕加一層蒸餾水覆蓋靜置30min以上；濃縮膠灌膠至玻璃板頂端，插好點樣梳，濃縮膠凝固后拔出點樣梳；

3）點樣：每粒種子取25μl提取液上樣；

4）電泳：步驟3）上樣完畢后，用電極緩沖液封樣，然后將電泳槽注滿電極緩沖液，滴加溴酚藍作指示劑，4-15℃條件下，每電泳槽20-40mA穩流電泳；30min后，調電流至50-70mA繼續穩流電泳，待指示劑至凝膠底部時結束電泳；

5）卸板、染色：電泳結束后，取出膠板，將分離膠轉移至染色液中染色30-40min后，置于觀片燈上讀帶；

6）純度計算：對比甘藍型油菜雜交種及其母本水溶蛋白譜帶的差異，統計制種樣中具有母本水溶蛋白電泳譜帶類型的個體數量；根據純度計算公式計算出甘藍型油菜雜交種種子純度，所述純度計算公式為：

水溶蛋白鑒定種子純度=（1-母本帶型數量/總檢測種子數量）×100％。

2.如權利要求1所述的水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，其特征在于：步驟1）中所述用于鑒定的甘藍型油菜雜交種種子及其母本種子的選取采取四分法取樣，具體為，將用于鑒定的甘藍型油菜雜交種種子晃動均勻，取出9-11g，放在紙上，剔除癟粒及霉、爛種子，采用四分法取樣。

3.如權利要求1所述的水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，其特征在于：步驟1）中所述用于鑒定的甘藍型油菜雜交種種子為“灃油520”甘藍型油菜雜交種種子。

4.如權利要求1所述的水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，其特征在于：步驟2）中所述分離膠為：300g丙烯酰胺，8g亞甲基雙丙烯酰胺，ddH₂O定容至1000ml，4℃保存。

5.如權利要求1所述的水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，其特征在于：步驟2）中所述濃縮膠為：100g丙烯酰胺，25g亞甲基雙丙烯酰胺，ddH₂O定容至1000ml,?4℃保存。

6.如權利要求1所述的水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，其特征在于：步驟4）中所述電極緩沖液為：360g三羥甲基氨基甲烷Tris，480ml?1mol/L的HCl，?4.6ml四甲基乙二胺TEMED，用?ddH₂O定容至1000ml,?4℃保存。

7.如權利要求1所述的水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，其特征在于：步驟5）中所述染色液為：12.5g三氯乙酸,30ml甲醇，27ml乙醇，10ml冰乙酸，0.015g考馬斯亮藍R-250，0.045g考馬斯亮藍G-250，ddH₂O定容至100ml，避光保存。

8.如權利要求1所述的水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，其特征在于：步驟4）中所述溴酚藍指示劑的用量為1滴0.2%溴酚藍。

9.如權利要求1所述的水溶蛋白鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度方法，其特征在于：還包括?純度驗證步驟，所述純度驗證具體步驟如下：

將用于鑒定的甘藍型油菜雜交種種子的制種樣同時進行種植鑒定和醇溶蛋白鑒定，其中種植鑒定利用盛花期育性表現調查純度，純度計算公式為：種植鑒定種子純度=（1-不育株數/總調查株數）×100％；醇溶蛋白鑒定利用雜交種與母本醇溶蛋白譜帶的差異，純度計算公式為：醇溶蛋白鑒定種子純度=（1-母本帶型數量/總檢測種子數量）×100％；分析三種方法的鑒定結果，驗證該方法進行純度鑒定的準確性。