[發(fā)明專利]一種火麻仁蛋白制備抗氧化肽的方法

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• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN112899330A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設計）人: 孔令羽;劉勝貴;蔣永昌;李智高;薛紅芬;張瓊
• 申請（專利權）人: 云南綠新生物藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/14;C12R1/125
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1.一種火麻仁蛋白制備抗氧化肽的方法，其特征在于，所述制備火麻仁蛋白抗氧化肽主要是通過枯草芽孢桿菌對火麻仁蛋白進行發(fā)酵，底物濃度火麻仁蛋白3%~5%，發(fā)酵物濃度枯草芽孢桿菌5%~15%，搖床轉速180-200r/min，發(fā)酵時間為24h，再經過凝膠層析柱和HPLC分離純化得到抗氧化肽純品。

2.根據權利要求1所述的一種含水溶性大麻二酚的啤酒飲料及其制備方法，其特征在于，包括以下步驟；

步驟1，火麻仁蛋白的制備

將火麻仁真空干燥，去殼，麻仁粉碎機粉碎，用超聲波細胞粉碎器去除火麻仁油脂得到火麻仁粕，用堿法提取蛋白質，真空干燥備用；

步驟2，菌株的活化和純化

配制營養(yǎng)瓊脂PDA培養(yǎng)基，滅菌；滅菌降溫后倒入平板種子培養(yǎng)基；接種菌株進行活化，挑選出生長良好的菌種備用；

步驟3，制備抗氧化肽

配制火麻仁蛋白粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌；滅菌降溫后將菌株接種至培養(yǎng)基中搖床發(fā)酵；發(fā)酵液離心取上清液，所得肽溶液以凝膠層析柱分離純化，收集洗脫組分的第二峰，液質聯(lián)用色譜分離鑒定，得到火麻仁抗氧化肽粗品；

步驟4，純化抗氧化肽

將所述火麻仁抗氧化肽粗品二次純化得抗氧化肽純品。

3.根據權利要求1所述的一種火麻仁蛋白制備抗氧化肽的方法，其特征在于，所述步驟1中，火麻仁外皮去掉后，用藥物粉碎機粉碎，過0.45-1.2mm網篩；超聲波細胞粉碎器去除火麻仁油，作用溫度25-27℃，功率200-220w，占空比20：20（s/s）,60min；堿液提取，PH為8.5，溫度45℃，料液比1:12（g/mL）,60min。

4.根據權利要求1所述的一種火麻仁蛋白制備抗氧化肽的方法，其特征在于，所述步驟2中，營養(yǎng)瓊脂PDA培養(yǎng)基配比為：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，瓊脂15g，去離子水1L，調PH至7.0，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管或三角瓶，121℃高壓滅菌15min。

5.根據權利要求1所述的一種火麻仁蛋白制備抗氧化肽的方法，其特征在于，所述步驟3中，火麻仁蛋白粉液體培養(yǎng)基：火麻仁蛋白粉3-5%，麩皮1%（w/v），0.5g紅糖粉，調PH至7.0，經121℃高壓滅菌15min；菌株接種量為5-15%，發(fā)酵液多肽得率最高，達32%；搖床轉速為180r/min，發(fā)酵時間為24h；發(fā)酵液8000r/min離心10min；凝膠柱洗脫液氯化鉀0.025mol/L-乙酸0.2mol/L，流速1-3ml/min。

6.根據權利要求1所述的一種火麻仁蛋白制備抗氧化肽的方法，其特征在于，所述步驟4中，二次純化包括以下步驟，

火麻仁抗氧化肽粗品通過磁化水溶解后過濾的抗氧化肽粗品溶液；

b)抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，依次在緩沖液和磁化水中透析后獲得抗氧化肽初純溶液；

c)抗氧化肽初純溶液通過反相色譜法精純后獲得抗氧化肽精純溶液；

d)抗氧化肽精純溶液通過HPLC法轉鹽，獲得抗氧化肽鹽溶液；減壓濃縮、干燥后得到火麻仁抗氧化肽純品。

7.根據權利要求5所述的抗氧化肽的制備方法，特征在于：所述二次純化步驟的磁化水中含有10~25ppm的乙酸；所述步驟b)的過程為：抗氧化肽的粗品溶液裝入都半透膜中，置于緩沖液中，于室溫下攪拌滲濾至緩沖液PH=3.2~3.5；然后將含有抗氧化肽溶液的半透膜轉移至磁化水中，室溫下攪拌滲濾至半透膜內溶液PH=4.6~5.0。

8.根據權利要求5或6所述的一種火麻仁蛋白制備抗氧化肽的方法，其特征在于，所述步驟c)的反相色譜法中，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，濃度為5mM~50mM的硫酸銨水溶液為A相，乙腈為B相；A相采用硫酸調節(jié)PH值至2.0~3.5；B相以10%~40%的梯度進行洗脫，洗脫時間為60min。

9.根據權利要求5或6所述的一種火麻仁蛋白制備抗氧化肽的方法，其特征在于，所述步驟d)的通過HPLC法轉鹽為通過醋酸銨和醋酸條件離子交換轉鹽；所述步驟d)的干燥采用減壓冷凍干燥的方式實現，操作過程為：預凍至-50~-10℃保持2~4h，使真空度恒定在0.01~1.00Mbar，升溫干燥至12~36h。