[發(fā)明專利]一種制備高純度乳鐵蛋白的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110446085.6
• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN112979785B
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 屈明哲
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江默賽東科技有限公司
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/36
• 代理公司: 北京坦路來專利代理有限公司 11652
• 代理人: 林樂飛

本發(fā)明涉及一種制備高純度乳鐵蛋白的方法，其包括以下步驟：(1)將脫脂液體乳進行預處理；(2)將經(jīng)過預處理的脫脂液體乳進行第一陽離子交換層析，其中上樣流速為500～1000cm/h，洗雜鹽溶液為濃度0.3～0.45M的金屬鹵化物水溶液，得到乳鐵蛋白溶液；(3)將乳鐵蛋白溶液進行超濾脫鹽或稀釋；(4)然后將經(jīng)過超濾脫鹽或稀釋的乳鐵蛋白溶液進行第二陽離子交換層析，其中上樣流速為50～400cm/h，洗雜鹽溶液為濃度0.35～0.55M的金屬鹵化物水溶液，得到乳鐵蛋白純度不低于95％的乳鐵蛋白溶液；(5)將高純度乳鐵蛋白溶液進行超濾濃縮和脫鹽，得到乳鐵蛋白原液。根據(jù)本發(fā)明，實現(xiàn)了規(guī)模化、低成本制備符合食品安全國家標準GB1903.17?2016，同時乳鐵蛋白回收率不低于62.5％的高純度乳鐵蛋白的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于乳制品加工技術(shù)領(lǐng)域，其涉及一種高純度乳鐵蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)，特別是以牛/羊乳、初乳或乳清為原材料，每批次制備公斤級以上符合國家標準GB1903.17-2016質(zhì)量要求的高純度乳鐵蛋白產(chǎn)品的方法。

背景技術(shù)

乳鐵蛋白(Lactoferrin)是動物乳中的天然蛋白質(zhì)，具有廣譜抗菌、抗病毒感染、調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的平衡、調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制人體腫瘤細胞生長的作用。嬰幼兒配方奶粉主要采用牛乳作為配方的基礎(chǔ)，但人乳中乳鐵蛋白濃度約為1.0～3.0mg/mL，是牛乳中的10倍(牛乳中含量為0.02～0.35mg/mL)，因此嬰幼兒配方奶粉中需要額外添加乳鐵蛋白，以使配方組成和功能更接近于人乳。因此，奶粉行業(yè)存在規(guī)模化使用乳鐵蛋白的實際需求。

2016年12月，我國衛(wèi)計委和食藥監(jiān)總局聯(lián)合發(fā)布了關(guān)于營養(yǎng)強化劑-乳鐵蛋白的食品安全國家標準GB1903.17-2016，其中對食品營養(yǎng)強化劑乳鐵蛋白的理化指標以及檢測方法提出明確的要求：乳鐵蛋白占總蛋白質(zhì)量百分比(w/％)≥95％，純度檢測方法為使用C4反相分析柱在高效液相色譜儀上進行分析。由此可見，出于對食品安全和產(chǎn)品質(zhì)量的高標準要求，需要開發(fā)規(guī)模化制備高純度乳鐵蛋白的方法。

目前已經(jīng)能夠使用陽離子交換層析、疏水層析、親和層析、電分離、交叉流過濾等技術(shù)互相配合，從乳、初乳或乳清中制備得到乳鐵蛋白。由于乳鐵蛋白和乳過氧化物酶是乳中少數(shù)帶有正電荷的蛋白質(zhì)分子，乳中其它蛋白和小分子物質(zhì)主要帶負電荷或電中性。因此，乳、初乳或乳清經(jīng)過陽離子交換層析柱時，乳鐵蛋白或乳過氧化物酶依靠和層析介質(zhì)之間異性電荷相互吸引結(jié)合到層析介質(zhì)上。由于這兩種蛋白所帶電荷量不同，乳過氧化物酶在陽離子交換層析介質(zhì)上的結(jié)合比乳鐵蛋白弱。通過低濃度的NaCl或KCl溶液，可先將乳過氧化物酶洗脫下來，進一步提高NaCl或KCl溶液的濃度，可洗脫得到純化的乳鐵蛋白溶液。由于陽離子交換層析具有分辨率高、結(jié)合載量大、成本低、易于放大等優(yōu)勢，成為工業(yè)化生產(chǎn)乳鐵蛋白的主流技術(shù)。

中國專利CN104926936A公布了一種使用陽離子交換樹脂純化乳鐵蛋白的方法，液體乳平均粒徑D90為1微米以下，所述液體乳在離子交換柱中保留時間為6～8分鐘，第一洗脫液為25～35質(zhì)量％的NaCl溶液，第二洗脫液為75～100質(zhì)量％的NaCl溶液。第二洗脫液經(jīng)過膜濃縮和脫鹽，得到乳鐵蛋白。在實際規(guī)模化生產(chǎn)中，液體乳在層析柱中的保留時間(對應于本發(fā)明的第一步陽離子交換層析的保留時間)超過4分鐘，并不能明顯提高樹脂對蛋白的吸附能力，反而大幅降低了層析步驟的生產(chǎn)效率，增加了未進行巴氏殺菌的液體乳中微生物大量滋長的風險。并且此文獻披露的第一步洗脫液25質(zhì)量％濃度對應的NaCl摩爾濃度為4.2mol/L，此濃度明顯過高，將會把所有結(jié)合在樹脂上的蛋白一起洗脫下來，無法實現(xiàn)蛋白分級純化的目的。此文獻所述方法制備的乳鐵蛋白純度為90～95％(根據(jù)食品安全國家標準GB1903.17-2016檢測純度約為84～89％之間)，未達到GB1903.17-2016乳鐵蛋白占總蛋白質(zhì)量百分比(w/％)≥95％的要求。