[發明專利]一種重組突變型Tn5轉座酶的制備及應用

有效

• 申請號: 202110445159.4
• 申請日: 2021-04-25
• 公開（公告）號: CN113136374B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發明（設計）人: 呂培濤;朱文俊
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/10;C12N15/62;C07K19/00;C12N15/70;C12Q1/6806
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 劉佳;蔡學俊

1.一種重組突變型Tn5轉座酶，其特征在于，所述重組突變型Tn5轉座酶構建方法包括：

（1）以原突變型Tn5轉座酶基因為模板，進一步改造突變M56A與E345K兩個位點，獲得Tn5m核苷酸片段；

（2）將Tn5m核苷酸片段與EF或TRX1核苷酸片段通過重組反應，獲得EF-Tn5m轉座酶或TRX1-Tn5m轉座酶的核苷酸片段；

（3）所述EF-Tn5m轉座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述TRX1-Tn5m轉座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

步驟（1）所述改造突變M56A與E345K兩個位點所需要的引物包括：

56A-F：5′-GGCAGCAAAGCCGCCCAGGAAGGCGCGTAT-3′；

56A-R：5′-ATACGCGCCTTCCTGGGCGGCTTTGCTGCC-3′；

345K-F：5′-CAGCGTATGGAAAAACCGGATAACCTG-3′；

345K-R：5′-CAGGTTATCCGGTTTTTCCATACGCTG-3′。

2.一種包含權利要求1所述重組突變型Tn5轉座酶的核苷酸序列的載體，其特征在于，將所述EF-Tn5m轉座酶、TRX1-Tn5m轉座酶的核苷酸片段利用同源重組分別克隆到表達載體pET30a中。

3.一種利用權利要求2所述載體表達制備重組突變型Tn5轉座酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將表達載體轉入C3013感受態細胞中，放入冰上孵育30 min，再熱激60 s，隨后冰上孵育5 min；加入200 μL LB液體培養基，放入搖床復蘇30 min后，涂布于終濃度50 μg/mL卡那霉素固體培養基上，37℃過夜培養；第二天挑取單菌落進行測序驗證；

（2）將含有正確目的序列的單菌落接種于10 mL LB液體培養基，37℃培養過夜，從中取1 mL 接種于100 mL LB液體培養基，擴大培養至OD600 = 0.5，加入終濃度0.25 mM的IPTG誘導重組突變型Tn5蛋白表達；誘導6 h后，用50 mL離心管收集菌體，用于蛋白純化；

（3）向菌體中加入10 mL 結合緩沖液 ，隨后于超聲波細胞破碎儀中進行菌體破碎，再加入50 μL PEI（Sigma，P3143）沉淀菌液中的DNA分子，在4℃ 12 ,000g條件下離心10 min取上層清液；將上清液加入到已經預先平衡好的親和柱中，待上清液流盡后，分別用結合緩沖液和漂洗緩沖液洗滌一次，然后加入10 mL 洗脫液，待液體流出一個柱體積后，封閉親和柱，放于4℃冰箱過夜，第二天釋放蛋白溶液，獲得重組突變型Tn5蛋白溶液；

（4）重組突變型Tn5轉座酶裝配：分別按摩爾比ME-A：ME-R = 1：1，ME-B：ME-R = 1：1進行混勻并退火形成Tn5 接頭A和接頭B，然后將接頭A與接頭B等體積比混合，得到Tn5接頭AB；將步驟（3）所述重組突變型Tn5蛋白溶液進行超濾濃縮并用儲存緩沖液置換，再按體積比1：0.5；1：1和1：2加入混合的Tn5接頭AB，最后加入終濃度為50%的甘油，混合均勻，20℃孵育40 min；

所述儲存緩沖液配方為：20 mM Tris-HCl pH 8.0；0.15 M NaCl；1 mM EDTA；

結合緩沖液配方為：10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 M NaCl；1 mM EDTA；10%甘油；0.1%Triton X-100；

漂洗緩沖液配方為：10 mM Tris-HCl pH 8.0；2 M NaCl；1 mM EDTA；10%甘油；0.1%Triton X-100；

洗脫液配方為：20 mM Tris-HCl pH 8 .0；0.5 M NaCl；1 mM EDTA；50 mM DTT。